光学传感新方法的构建及其在生物小分子检测中的应用研究

摘要

随着生命科学和现代医学研究从传统的细胞、组织、器官水平向分子水平的转移和发展，对直接影响生命活动正常进行的各类生物分子进行快速、准确、灵敏、实时的检测和分析对于从分子水平上揭示生命过程，实现对重大疾病的预防和治疗等方面具有重要意义。在众多检测方法中，光学传感技术因其灵敏度高、选择性好、操作简单、响应快速、光谱学性质多变、可在复杂体系中进行连续测定等优点得到了广泛关注，为生物分子，如核酸、蛋白质、生物小分子等的检测提供了新的平台，有望成为生物分析检测领域强有力的研究工具。本论文着眼于几种重要的生物小分子，将光学传感技术与纳米材料、荧光染料、功能核酸等相结合，构建了用于抗坏血酸（AA），三磷酸腺苷（ATP），谷胱甘肽（GSH）定性和定量分析的新型光学传感方法。具体的研究内容如下： 1. 基于氢氧化氧钴纳米片层和3,3',5,5'-四甲基联苯胺比色法检测AA 本工作首次报道了氢氧化氧钴（CoOOH）纳米片层对 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）具有很强的氧化性，并基于此开发了一种用于 AA 定性和定量分析的比色传感新方法。在本设计中，CoOOH 纳米片层能将 TMB 直接氧化成oxTMB，在652 nm处出现很强的吸收峰，溶液由无色变为蓝色，而AA可将CoOOH纳米片层分解成Co2+，抑制了TMB的氧化和溶液变蓝。因此，可通过记录紫外可见吸收光谱的变化和肉眼观察溶液颜色的变化来判断溶液中 AA的浓度。在最佳实验条件下，AA的检测限低至142 nM，检测时间仅为5分钟。本传感方法也成功地应用于人血清样本、药片和维生素饮料中的AA含量分析，展现了其在实际样本测定中的应用潜力。此外，基于肉眼可观察的体系颜色变化，初步构建了AA的纸基检测方法，并取得了满意的结果。 2. 基于核酸适配体和硫黄素T荧光法检测ATP 硫黄素T（ThT）可以与G-四链体DNA特异性结合产生很强的荧光，本工作采用ThT作为荧光指示剂，开发了一种无标记的ATP荧光传感方法。ATP的核酸适配体折叠形成的三维结构允许ThT的插入并产生很强的荧光信号；然而，当体系中存在ATP时，ATP会优先与其核酸适配体结合，使DNA的构象发生改 变而阻止 ThT的插入，因而抑制体系荧光强度的增加。因此，通过分析反应体系荧光强度的变化，可以对 ATP 进行检测。本方法操作简单，响应快速，可在0.1至1000μM的浓度范围内对ATP产生响应，检测限低至33 nM，并成功地应用于人血清样本和细胞裂解液中ATP的检测。 3. 基于银离子介导的G-四链体构象转换平台荧光法检测GSH 在本工作中，基于Ag+介导的G-四链体DNA和荧光染料NMM，开发了一种高灵敏的GSH 荧光传感平台。NMM是一种 G-四链体识别探针，可以和 G-四链体特异性结合使自身荧光增强。本工作采用一条富含鸟嘌呤G的DNA序列，该DNA链可以发生分子内杂交形成一个发夹结构，富G序列被封闭在发夹结构内，无法形成G-四链体。当体系中存在Ag+时，Ag+会与DNA序列中的胞嘧啶（C）形成C-Ag+-C错配碱基对而破坏发夹结构，富G序列被释放形成G-四链体，和NMM结合在612 nm处产生很强的荧光。然而，在GSH存在的条件下，Ag+会优先和GSH结合，无法形成C-Ag+-C结构。DNA恢复到原来的构象，释放 NMM 使体系荧光降低。因此，通过记录反应过程中体系荧光强度的变化，可以对Ag+和GSH进行检测。本方法对GSH检测具有较高的灵敏度，检测限低至3.5 nM，并成功地应用于细胞裂解液中GSH浓度的测定。

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