LncRNA XLOC_005950介导hsa-miR-542-3p对骨肉瘤细胞能量代谢及增殖的调节

摘要

研究背景 骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一种起源于骨母细胞，最常见的原发性恶性骨肿瘤，可发生在任何年龄，好发于四肢长骨干骺端，最为典型的是青少年的股骨下端与胫骨上端。骨肉瘤细胞以形成骨样基质为特征，但其组织形态与成骨细胞产生的骨质存在着很大的差异。近年来，针对骨肉瘤的研究重点已经转移到生物大分子与基因层次。生物大分子的异常高表达或低表达，基因突变等多种因素促进了骨肉瘤的发生与发展。人们希望从骨肉瘤的生物学研究方面取得突破并最终用于临床达到对该病的防治。骨肉瘤研究的临床目标是找到影响预后的因子，其不仅可以作为个体化治疗的理论依据，还有助于新治疗药物的临床试验的优选。长链非编码RNA（longnon-coding RNA，lncRNA）是一种长度大于 200 核苷酸（nucleotide，nt）的非编码 RNA，其在人体基因组中分布非常广泛，且具有广泛的生物学功能，如发挥分子诱饵作用，作为ceRNA调控miRNA与mRNA的表达。在肿瘤的代谢中，肿瘤的代谢重编程既满足了肿瘤对能量的需求，又提供了肿瘤细胞快速增殖的大分子物质基础，提供的酸性微环境有助于肿瘤细胞逃避免疫系统。LncRNA XLOC_005950由Moran等在基因芯片的分析中发现，我们在前期预实验中发现此lncRNA在骨肉瘤组织中高表达。因此，研究非编码RNA（lncRNA XLOC_005950）对骨肉瘤能量代谢途径的调节及其作用的分子机制，为探讨骨肉瘤的发生发展、诊治及预后提供新靶点和新思路具有重要价值和意义。 研究目的 本实验首先检测骨肉瘤患者组织标本及其配对的癌旁组织与正常成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞MG63中LncRNA XLOC_005950及磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase Muscle，PFKM）的表达差异。采用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除MG63中LncRNA XLOC_005950，观察细胞中PFKM的表达、乳酸含量、葡萄糖含量和细胞增殖活性及凋亡率的变化。并使用生物信息学方法预测LncRNA XLOC_005950调控PFKM的微小RNA（MicroRNA，miRNA）分子及调控方式，转染后验证其调控方式。因此，本研究旨在探讨lncRNA XLOC_005950对骨肉瘤细胞有氧糖酵解能量代谢途径的调节及细胞增殖与凋亡的影响，此结果将对肿瘤生物学行为和后期的临床研究具有重大意义。 研究方法 1. 在郑州大学第一附属医院（2015年9月至2017年3月期间）收集25例骨肉瘤患者的癌组织及其配对的癌旁组织，使用荧光实时定量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测已收集组织标本中LncRNA XLOC_005950与PFKM mRNA的表达。并检测成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞MG63中LncRNA XLOC_005950与PFKM mRNA的表达。 2. 使用 CRISPR/Cas9 基因编辑方法敲除骨肉瘤 MG63 细胞中 LncRNA XLOC_005950。 3.敲除LncRNA XLOC_005950后的骨肉瘤细胞MG63标为MG63-/-，检测细胞MG63-/-指标的变化： （1）qRT-PCR检测MG63-/-中PFKM mRNA的表达变化。 （2）检测MG63-/-中PFKM活性、葡萄糖和乳酸含量，观察骨肉瘤细胞MG63的糖酵解效率变化。 （3）CCK-8检测MG63-/-的细胞活性和增殖变化。 （4）流式细胞术检测MG63-/-细胞凋亡率的变化。 （5）Western Blot检测MG63-/-中PFKM蛋白表达的变化。 4.采用Diana Tools，TargetScan，miRbase等生物信息学软件预测与LncRNA XLOC_005950及PFKM结合的miRNA。 5. qRT-PCR检测骨肉瘤组织和其癌旁组织及骨肉瘤细胞MG63、MG63-/-和成骨细胞hFOB1.19中hsa-miR-542-3p的表达。 6.合成hsa-miR-542-3p mimics和hsa-miR-542-3p negative control，采用脂质体转染法将其分别转染入MG63细胞中，实验分组： （1）miR-542组：转染试剂脂质体及hsa-miR-542-3p mimics； （2）NC组：转染试剂脂质体及hsa-miR-542-3p negative control； （3）Blank组：转染试剂脂质体。 7.骨肉瘤细胞MG63转染hsa-miR-542-3p mimics后，检测hsa-miR-542-3p对其细胞影响： （1）qRT-PCR检测细胞中PFKM的mRNA表达水平。 （2）检测细胞中PFKM活性、葡萄糖和乳酸含量，观察MG63细胞糖酵解效率改变。 （3）CCK-8检测MG63细胞的活性和增殖。 （4）流式细胞术观察MG63细胞凋亡率的变化。 （5）Western Blot检测MG63细胞中PFKM蛋白的表达。 8. 双荧光素酶报告实验证实：PFKM是hsa-miR-542-3p作用的靶基因，LncRNA XLOC_005950是hsa-miR-542-3p作用的靶标。 研究结果 1.与癌旁组织比较，骨肉瘤组织中LncRNA XLOC_005950及PFKM mRNA的表达水平均显著升高（P<0.01）；与成骨细胞hFOB1.19比较，骨肉瘤细胞MG63中LncRNA XLOC_005950及PFKM mRNA的表达水平显著升高（P<0.01）。 2. 测序结果显示，与正常骨肉瘤细胞 MG63 相比，MG63-/-细胞的lncRNA XLOC_005950 已被编辑，出现大片段缺失，表明成功构建了基因编辑敲除lncRNA XLOC_005950的骨肉瘤细胞MG63-/-。 3. MG63-/-细胞中代谢及性状的改变： （1）MG63-/-中PFKM mRNA表达明显降低（P<0.05）。 （2）MG63-/-中PFKM活性下降（P<0.05）、葡萄糖含量下降（P<0.01）及细胞中乳酸含量下降（P<0.05）。表明细胞中糖酵解效率降低。 （3）MG63-/-的增殖活性下降（P<0.05）。 （4）MG63-/-的细胞凋亡显著增加，凋亡率上升（P<0.05）。 （5）MG63-/-中PFKM蛋白表达下降。 4.生物信息学分析，hsa-miR-542-3p与LncRNA XLOC_005950及PFKM有匹配结合区域。 5. 与癌旁组织比较，骨肉瘤组织中hsa-miR-542-3p的表达水平降低（P<0.05）；与成骨细胞hFOB1.19比较，骨肉瘤MG63细胞中hsa-miR-542-3p的表达水平显著降低,差异有显著统计学意义（P<0.01）。而当 MG63 细胞基因编辑敲除LncRNA XLOC_005950，MG63-/-组中hsa-miR-542-3p的表达与MG63组比较其表达显著上调，差异具有统计学意义（P<0.05）。 6.骨肉瘤细胞MG63转染hsa-miR-542-3p mimics后，转染后细胞变化： （1）转染细胞中PFKM的mRNA 表达降低（P<0.05）。 （2）转染细胞中 PFKM 活性下降（P<0.05）、葡萄糖含量及乳酸含量均下降（P<0.05）。表明转染hsa-miR-542-3p mimics的细胞中糖酵解效率降低。 （3）转染细胞的增殖活性下降（P<0.05）。 （4）转染细胞MG63细胞凋亡明显增加，凋亡率上升（P<0.05）。（5）转染细胞中PFKM蛋白表达下降。 7.双荧光素酶报告实验结果显示，LncRNA XLOC_005950及PFKM均为hsa-miR-542-3p的作用靶标。 结论 1.骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞MG63中，LncRNA XLOC_005950和PFKM均高表达，hsa-miR-542-3p低表达。 2.基因编辑敲除lncRNA XLOC_005950或转染hsa-miR-542-3p后，骨肉瘤细胞MG63糖酵解关键酶PFKM表达下降、细胞内葡萄糖及乳酸含量下降，骨肉瘤细胞的主要供能方式有氧糖酵解受抑制。同时，骨肉瘤细胞的增殖活性受到抑制，凋亡率增加。 3. lncRNA XLOC_005950可以通过hsa-miR-542-3p调控PFKM的表达，阻止骨肉瘤细胞的有氧糖酵解途径，抑制肿瘤细胞的主要能量供应，进而调控骨肉瘤细胞的增殖与凋亡。

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