lncRNA ANRIL在骨肉瘤组织中的表达及其对骨肉瘤细胞增殖凋亡和侵袭迁移的影响

摘要

研究背景和目的:
　　骨肉瘤是骨外科常见的恶性肿瘤，其起源于骨髓间充质干细胞，且好发青少年儿童。手术及放化疗联合应用是本病目前治疗的基本手段，伴随手术方式的改进和新型化疗药物的应用使得本病的预后有了较为明显的改善，但仍约有40％的患者治疗后出现肿瘤转移，五年生存率未有明显提高，这预示仍需新的治疗方法来改善患者愈后，发现新的基因对骨肉瘤的影响似乎是一种有效的手段。长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。做为遗传学研究热点，许多研究表明， lncRNA在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用。lncRNA表达量的变化或其功能异常与导致人类疾病的发生密切相关，包括癌症、退行性神经疾病等在内的许多对人类健康危害严重的重大疾病，具体表现为lncRNA在序列和空间结构的异常、表达水平的异常、与结合蛋白相互作用的异常等。lncRNA ANRIL是细胞周期激酶抑制因子4b(INK4b)位点的反义非编码RNA( antisense non-coding RNA in the INK4 Locus)，其表达与INK4a的表观遗传学沉默相关。INK4b-ARF-INK4a位点对细胞周期、衰老和调亡的调控中具有重要的作用。然而，关于lncRNA ANRIL对骨肉瘤细胞生物学行为的影响尚未见报道。因此，探讨lncRNA ANRIL对人骨肉瘤细胞生物学功能的影响，从而为骨肉瘤的临床治疗提供新的思路和策略。
　　本实验通过收集骨肉瘤癌组织及癌旁组织的标本，比较lncRNA ANRIL在癌组织及癌旁组织表达的差异。将小干扰 RNA（siRNA）分子转染进入骨肉瘤细胞来抑制lncRNA ANRIL基因的表达，观察抑制lncRNA ANRIL的表达对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭迁移能力的影响，为lncRNA ANRIL在骨肉瘤的防治中提供实验依据。
　　方法:
　　1.在郑州大学第一附属医院骨科手术室收集25例配对骨肉瘤患者的癌组织及癌旁组织标本，保存于-80℃冰箱。使用荧光实时定量 PCR（ real-time quantitative PCR, RT-qPCR）方法检测25例配对骨肉瘤癌组织及癌旁组织标本中lncRNA ANRIL的表达水平。
　　2.试剂公司人工合成lncRNA ANRIL的抑制物：siRNA-ANRIL。实验分为三组，实验组（siRNA-ANRIL）：将 siRNA-ANRIL转染入骨肉瘤细胞 MG63中，阴性对照组（Nagetive control，NC）：转染lncRNA ANRIL Nagetive control，空白组（Blank）：仅转染脂质体。转染后，将细胞至于CO2培养箱中，用于后续实验。
　　3.转染48h后，用 RT-qPCR技术测量三组细胞内lncRNA ANRIL基因的表达量，观察siRNA-ANRIL对lncRNA ANRIL表达的抑制效果。
　　4.利用CCK-8细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）在处理24h、48h、72h、96h后分别测量三组细胞的增殖能力，观察抑制lncRNA ANRIL表达对骨肉瘤细胞增殖的影响。5.用流式细胞技术和caspase-3酶活性检测试剂盒分别对三组细胞的凋亡进行测量，观察抑制lncRNA ANRIL表达后对骨肉瘤细胞凋亡的影响。6. Transwell侵袭实验，抑制lncRNA ANRIL表达后在12h时观察对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响。7.划痕实验，对三组骨肉瘤细胞进行划痕处理，在处理12h后观察抑制l8.利用蛋白质印迹法（Western blot）分别检测转染后的三组骨肉瘤细胞中肿瘤转移相关基因1蛋白（metastasis-associaled gene1，MTA1），上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad），B淋巴细胞瘤-2蛋白（bcl-2）的表达量。结果1.与癌旁组织相比，骨肉瘤癌组织中lncRNA ANRIL基因的表达水平明显增高，其差异具有统计学意义(P<0.05)。2. RT-qPCR结果显示，转染后siRNA-ANRIL组lncRNA ANRIL基因的表达水平明显低于阴性对照组和空白组，其差异具有统计学意义(P<0.05)，阴性对
　　4.利用CCK-8细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）在处理24h、48h、72h、96h后分别测量三组细胞的增殖能力，观察抑制lncRNA ANRIL表达对骨肉瘤细胞增殖的影响。
　　5.用流式细胞技术和caspase-3酶活性检测试剂盒分别对三组细胞的凋亡进行测量，观察抑制lncRNA ANRIL表达后对骨肉瘤细胞凋亡的影响。
　　6. Transwell侵袭实验，抑制lncRNA ANRIL表达后在12h时观察对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响。
　　7.划痕实验，对三组骨肉瘤细胞进行划痕处理，在处理12h后观察抑制ncRNA ANRIL表达后对骨肉瘤细胞迁移能力的影响。
　　8.利用蛋白质印迹法（Western blot）分别检测转染后的三组骨肉瘤细胞中肿瘤转移相关基因1蛋白（metastasis-associaled gene1，MTA1），上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad），B淋巴细胞瘤-2蛋白（bcl-2）的表达量。
　　结果:
　　1.与癌旁组织相比，骨肉瘤癌组织中lncRNA ANRIL基因的表达水平明显增高，其差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　2. RT-qPCR结果显示，转染后siRNA-ANRIL组lncRNA ANRIL基因的表达水平明显低于阴性对照组和空白组，其差异具有统计学意义(P<0.05)，阴性对照组和空白组lncRNA ANRIL表达量无明显差异(P>0.05)。
　　3. CCK-8结果显示，siRNA-ANRIL组的骨肉瘤细胞在OD450处的吸光度值明显下降，且随时间延长，吸光度值与阴性对照组和空白组相比差异越明显，其差异具有统计学意义(P<0.05)，阴性对照组和空白组的吸光度值相近，且随时间变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。4.流式细胞技术和caspase-3酶活性检测试剂盒结果均表明，与阴性对照组和空白组相比，siRNA-ANRIL组的骨肉瘤细胞的凋亡率和 Caspase-3酶活性均明显升高，其差异具有统计学意义(P<0.05)，阴性对照组和空白组骨肉瘤细胞的凋亡率和Caspase-3酶活性无明显差异(P>0.05)。5. Transwell侵袭实验结果显示，siRNA-ANRIL组骨肉瘤细胞穿过基底膜的数量明显低于阴性对照组和空白组，其差异具有统计学意义(P<0.05)，而阴性对照组和空白组骨肉瘤细胞穿过基底膜的数量差异无统计学意义(P>0.05)。6.对三组细胞进行划痕处理12h以后的结果提示，siRNA-ANRIL组骨肉瘤细胞的迁移能力与阴性对照组和空白组相比明显降低，阴性对照组和空白组骨肉瘤细胞的迁移能力无明显差异。7. Western blot结果显示，siRNA-ANRIL组中MTA1表达量降低，E-cad表达量升高，bcl-2蛋白表达量降低，与阴性对照组和空白组相比较，其差异具有统计学意义(P<0.05)，而阴性对照组和空白组MTA1，E-cad和bcl-2蛋白的表达量相近，差异无统计学意义(P>0.05)。结论1. lncRNA ANRIL在骨肉瘤癌组织的表达高于癌旁组织，且可通过使用s2.抑制lncRNA ANRIL基因的表达能够促进骨肉瘤细胞的凋亡，且能够抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力。
　　3. CCK-8结果显示，siRNA-ANRIL组的骨肉瘤细胞在OD450处的吸光度值明显下降，且随时间延长，吸光度值与阴性对照组和空白组相比差异越明显，其差异具有统计学意义(P<0.05)，阴性对照组和空白组的吸光度值相近，且随时间变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。
　　4.流式细胞技术和caspase-3酶活性检测试剂盒结果均表明，与阴性对照组和空白组相比，siRNA-ANRIL组的骨肉瘤细胞的凋亡率和 Caspase-3酶活性均明显升高，其差异具有统计学意义(P<0.05)，阴性对照组和空白组骨肉瘤细胞的凋亡率和Caspase-3酶活性无明显差异(P>0.05)。
　　5. Transwell侵袭实验结果显示，siRNA-ANRIL组骨肉瘤细胞穿过基底膜的数量明显低于阴性对照组和空白组，其差异具有统计学意义(P<0.05)，而阴性对照组和空白组骨肉瘤细胞穿过基底膜的数量差异无统计学意义(P>0.05)。
　　6.对三组细胞进行划痕处理12h以后的结果提示，siRNA-ANRIL组骨肉瘤细胞的迁移能力与阴性对照组和空白组相比明显降低，阴性对照组和空白组骨肉瘤细胞的迁移能力无明显差异。
　　7. Western blot结果显示，siRNA-ANRIL组中MTA1表达量降低，E-cad表达量升高，bcl-2蛋白表达量降低，与阴性对照组和空白组相比较，其差异具有统计学意义(P<0.05)，而阴性对照组和空白组MTA1，E-cad和bcl-2蛋白的表达量相近，差异无统计学意义(P>0.05)。
　　结论:
　　1. lncRNA ANRIL在骨肉瘤癌组织的表达高于癌旁组织，且可通过使用iRNA-ANRIL来抑制骨肉瘤细胞lncRNA ANRIL的表达。
　　2.抑制lncRNA ANRIL基因的表达能够促进骨肉瘤细胞的凋亡，且能够抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

目录

声明

1. 引言

2. 材料和方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3. 实验结果

3.2 RT-qPCR 技术检测 siRNA-ANRIL 转染入骨肉瘤细胞后对lncRNA ANRIL基因表达的影响

3.3 CCK-8试剂盒检测检测抑制lncRNA ANRIL的表达对骨肉瘤细胞增殖能力的影响

3.4 流式细胞技术和 caspase-3 酶活性检测试剂盒检测抑制 lncRNA ANRIL的表达对骨肉瘤细胞凋亡能力的影响

3.5 Transwell侵袭实验检测抑制lncRNA ANRIL的表达对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响

3.6 划痕实验检测抑制lncRNA ANRIL的表达对骨肉瘤细胞迁移能力的影响

3.7 Western blot 检测抑制lncRNA ANRIL的表达对骨肉瘤细胞中MTA1, E-cad和bcl-2蛋白表达的影响

4. 讨论

5. 结论

参考文献

综述:lncRNA在骨肉瘤防治作用中的研究进展

中英文缩略词表

个人简历

致谢