ABO基因启动子区CpG岛甲基化与多囊卵巢综合征的相关性研究

摘要

背景和目的 多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种女性常见的内分泌代谢紊乱性疾病，育龄期女性的患病率高达6%-10%，以稀发排卵或不排卵、高雄激素血症、卵巢多囊样改变和月经紊乱为主要临床特征。PCOS除了影响女性的生育功能外，研究发现它可能还会增加女性患肥胖症、胰岛素抵抗（IR）、2型糖尿病（DM2）和心血管疾病的风险。尽管它的发病机制尚不清楚，但积累的数据表明，多囊卵巢综合征是一种既涉及遗传因素又涉及环境因素的复杂疾病。目前，许多学者认为 PCOS的发病机制与表观遗传学有关，但具体的作用机制尚无定论。 表观遗传学是一种在DNA序列没有发生改变的情况下导致基因表型改变的分子机制。表观遗传学研究包括DNA甲基化、组蛋白修饰、和基因组印迹等方面。DNA甲基化是指在甲基转移酶（DNMT)的作用下将S-腺苷甲硫氨酸（SAM）上的甲基基团转移到CpG二核苷酸中胞嘧啶的第5位碳原子上形成5-甲基化胞嘧啶（5mC)的过程。通常认为，DNA甲基化会阻碍转录因子与CpG二核苷酸顺式作用元件的结合，从而抑制基因的表达。目前有研究表明，PCOS一些候选基因DNA甲基化的改变与该疾病的发病机制有着密切的联系。 前期我们调查研究了1035名女性，发现A、B、AB和O血型发生月经紊乱的比率分别为64.3%、59.8%、61.5%、81.3%，并且O血型组分别与A、B和AB血型组比较差异均有统计学意义，这一发现目前在国内外尚未见报道。月经紊乱是多囊卵巢综合征的一项基本的临床表现，所以我们有理由推测ABO血型基因与PCOS的发生机制可能存在某种联系。 ABO血型基因位于第9号染色体上（9q 34.1-34.2），在ABO血型基因座上有三个主要的等位基因，即A、B和O。研究发现，ABO血型基因启动子区CpG位点甲基化的改变与许多疾病有关。然而，ABO血型基因甲基化的状态与PCOS的发生是否有关联，尚未有文献报道。 根据以上背景提出假说：ABO 血型基因可能通过启动子区甲基化的改变调控基因的表达，从而影响PCOS的发生机制。本研究将从ABO血型基因表观遗传学的新角度来探讨 PCOS的发病机制。届时，可以对 PCOS的病理学机制提供理论依据，对 PCOS的早期诊断以及 PCOS 远期并发症的预防都有很大的帮助。 研究对象 1. PCOS患者 随机选取从2016年9月至2017年12月在河南省人民医院内分泌科就诊的20例PCOS患者，平均年龄为24.60 ± 4.68岁。PCOS诊断标准根据2003年欧洲人类生殖和胚胎学会/美国生殖医学学会（ESHRE/ASRM）鹿特丹专家会议推荐的标准,并经临床检查（症状体征、卵巢超声、生化检验和内分泌激素测定）确诊。 2. 健康对照者 随机选取与 PCOS 患者年龄和体重指数相匹配、近三个月未服用过激素类药物且无内分泌和高血压等相关疾病的20 例健康对照者，平均年龄为 23.35 ±3.52 岁。 所有研究对象均为中国北方汉族人，长期居住在河南地区，且无血缘关系。该项目已经通过郑州大学和河南省人民医院伦理委员会的批准，所有研究对象均签署知情同意书。 研究方法 1. 玻片法检测ABO血型 使用玻片法检测所有研究对象的ABO血型。 2. 红细胞表面ABH抗原的检测 红细胞表面A、B抗原的检测选用来源于小鼠的单克隆抗A或B抗体作为一抗，二抗选用FITC标记兔抗小鼠；H抗原的检测选用H抗原特异性荧光标记凝集素（Lectin fromUlex europaeus，FITC标记)。应用流式细胞仪进行检测。 3. ABO血型基因mRNA的相对表达水平 运用q-PCR技术检测和分析PCOS患者与健康对照者外周血中ABO基因的mRNA表达水平。 4. ABO血型基因启动子区的甲基化水平 应用MethyTarget目的区域富集甲基化测序法检测ABO血型基因启动子区28个CpG位点的甲基化水平。 本研究所有实验数据的分析运用SPSS21.0软件，并用GraphPad Prism 5软件绘制柱状图。定量数据均用均数±标准差（mean±SD)表示，比较两组之间的定量资料使用两独立样本t检验的方法，多组间定量资料的比较采用单因素方差分析的方法。检验水准α=0.05，P<0.05表示差异有统计学意义。 结果 1. 使用玻片法将研究对象的的血型分为A、B、AB和O型。20例PCOS患者中O血型6例，A血型9例，B血型4例，AB血型1例。20例健康对照者中O血型8例，A血型5例，B血型4例，AB血型3例。 2. B血型PCOS组红细胞表面的B抗原表达显著低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05)，但 H 抗原的表达与健康对照组相比无统计学差异（P>0.05）；O血型PCOS组红细胞表面的H抗原表达显著低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；A血型和AB血型PCOS组红细胞表面的A抗原、B抗原和H抗原的表达与健康对照组相比较均无统计学差异（P>0.05）。 3. B血型PCOS组ABO基因mRNA的表达水平显著低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；O血型PCOS组ABO基因mRNA的表达水平显著低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.001）。A血型和AB血型PCOS组ABO基因mRNA的表达水平与健康对照组的差异无统计学意义（P>0.05）。 4. PCOS组只有CpG4位点的平均甲基化水平低于健康对照组，其余27个CpG 位点的平均甲基化水平均高于健康对照组，但差异均无统计学意义（P>0.05）；B血型中PCOS组所有CpG位点的平均甲基化水平均高于健康对照组，但两组间只有CpG16、CpG18、CpG19和CpG26四个位点的平均甲基化水平有显著差异，差异具有统计学意义（P<0.05）；O血型、A血型以及AB血型中PCOS组的28个CpG位点平均甲基化水平与健康对照组均有差异，但差异均无统计学意义（P>0.05）。 结论 B血型PCOS组ABO基因表达下降与ABO基因启动子区高甲基化的改变具有相关性，需要扩大样本量进一步验证。研究结果显示ABO基因的高甲基化状态是PCOS易感性的潜在因素。

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