黑曲霉C2-56木聚糖酶（小麦抗营养因子降解酶）的分离纯化方法和性质研究

摘要

本试验在前期小麦抗营养因子降解酶黑曲霉C2-56成功筛选的基础上，运用层析和双水相萃取的方法研究了不同纯化方法对黑曲霉C2-56产木聚糖酶的纯化效果，并对纯化酶的性质进行了的研究，试验结果表明： 1、黑曲霉C2-56木聚糖酶组成上，通过凝胶过滤层析和离子交换层析两步分离得该酶由两种成分组成，命名为Xyn Ⅰ和XynⅡ，二者分子量分别为26.20kD和121.41kD，其中酶活力较高的是分子量较小的Xyn Ⅰ组分。 2、通过筛选得到黑曲霉C2-56木聚糖酶分离纯化较好的条件。70％饱和度的硫酸铵可使木聚糖酶活力和蛋白质含量都较高，确定粗酶硫酸铵分级沉淀的最佳浓度为70％。Test-tube试验法发现，当缓冲液pH值为6.0时，上清液中木聚糖酶的相对酶活明显低于6.0后的，故选择pH值6.0的柠檬酸缓冲液作为木聚糖酶上离子交换柱时的缓冲体系。 3、黑曲霉C2-56木聚糖酶纯化策略为：通过硫酸铵盐析、透析脱盐、Sephadex G-100凝胶过滤，DEAE Sepharose Fast Flow离子交换等方法，分离提纯到黑曲霉C2-56木聚糖酶中的Xyn Ⅰ和Xyn Ⅱ组分。两个组分分别达到电泳均一程度，Xyn Ⅰ组分的纯化倍数和回收率分别为10.53和4.09％，Xyn Ⅱ组分的纯化倍数和回收率分别为2.33和0.74％。针对层析法两组分回收率较低的问题，用双水相萃取技术尝试分离纯化效果，得对Xyn Ⅰ组分而言，当选择PEG6000系列时，当选择PEG浓度为5％，磷酸盐浓度为10％，NaCl浓度为20％，木聚糖酶起始浓度为20mg/mL时，酶回收率最高，达到94.09％，纯化倍数为2.81倍，回收率和纯化倍数都较高。对XynⅡ组分而言，当选择PEG6000浓度为25％，磷酸盐浓度为9％，NaCl浓度为5％，木聚糖酶起始浓度为20mg/mL时，酶回收率最高，达到79.09％，纯化倍数为1.12倍，具有较好的纯化效果。对层析法而言，木聚糖酶各组分的纯化倍数相对较高，但是经历了多步纯化过程后，酶的回收率很低；PEG/磷酸盐双水相萃取具有成本低、操作简单、收率高、纯化效果好等优点。针对不同的生产要求，我们可以选用不同的纯化条件和方法及其组合。 4、纯化酶的性质：Xyn Ⅰ组分最适反应pH值为6.0，最适反应温度为60℃，在pH9.5时酶活比pH6.0时下降了61.01％，在70℃处理60min，剩余酶活仅有原来的39％，说明Xyn Ⅰ组分耐热性和酸碱稳定性较差。XynⅡ组分最适反应pH值也为6.0，最适反应温度为55℃，在pH9.5时酶活比pH6.0只下降了28.99％，在70℃处理60min，剩余酶活仍有最高酶活的65％以上，说明该组分有较强的耐热性和耐碱性。Mg<'2+>、Cu<'2+>、K<'+>、Na<'+>、Ag<'+>、Zn<'2+>、Ca<'2+>对Xyn Ⅰ有极显著的促进作用，Hg<'2+>和Fe<'2+>对其有极显著的抑制作用。Na<'+>对Xyn Ⅱ有显著的促进作用，Mn<'2+>、Ag<'+>对其有极显著的抑制作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

0前言

0.1小麦抗营养因子特性及研究意义

0.2木聚糖酶及其应用研究

0.2.1木聚糖酶来源及性质

0.2.2木聚糖酶的应用

0.3木聚糖酶分离纯化相关技术

0.3.1层析法

0.3.2超滤

0.4木聚糖酶分离纯化研究进展

0.4.1目前应用的木聚糖酶非特异性分离纯化方法

0.4.2目前应用的木聚糖酶特异性分离纯化方法

0.4.3目前应用的木聚糖酶其它分离纯化方法

0.4.4目前应用研究进展

0.5本试验的研究意义

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1产酶菌株

1.1.2试剂

1.1.3试验器材

1.1.4部分贮液及凝胶电泳配方

1.2试验方法

1.2.1粗酶液的制备

1.2.2酶活力的测定及活力单位定义

1.2.3蛋白质含量测定方法

1.2.4电泳方法

1.2.5黑曲霉C2-56木聚糖酶分离纯化方法

1.2.6黑曲霉C2-56木聚糖酶纯化酶性质研究

2结果与分析

2.1粗酶组成成分的测定

2.1.1变性电泳测定粗酶中蛋白组成

2.1.2 PAGE活性电泳测定木聚糖酶组成成分

2.1.3 PAGE活性电泳条件的摸索

2.2黑曲霉C2-56木聚糖酶分离纯化条件的选择

2.2.1盐析(NH4)2SO4饱和度的选择

2.2.2离子交换层析缓冲液pH条件的选择

2.2.3不同层析方法的选择

2.2.4几种纯化方法的比较

2.2.5小试水平试验

2.3纯化酶的性质研究

2.3.1酶的分子量

2.3.2纯化酶最适反应温度

2.3.3纯化酶最适反应pH值

2.3.4纯化酶的热稳定性

2.3.5化学试剂对纯化酶活力的影响

3讨论与结论

3.1黑曲霉C2-56菌株产木聚糖酶的组成成分

3.2关于木聚糖酶的分离纯化

3.2.1盐析(NH4)2SO4饱和度的选择

3.2.2纯化过程缓冲体系的选择

3.2.3木聚糖酶的纯化策略

3.3纯化酶性质

3.4纯化方法的比较

3.5结论

3.6展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文

致谢