斯钙素基因在二乙基亚硝胺诱导大鼠肝癌发生中的表达研究

摘要

斯钙素(stanniocalciu，STC)是一类首先在鱼类特有的内分泌腺体-斯坦尼氏小体(corpuscles of Stannius，CS)，随后又在人、大鼠、小鼠等哺乳动物中发现同型二聚体糖蛋白激素。人和哺乳类STC(Mammalian stanniocalcin-1，STC1)具有广泛的组织表达模式，包括肾脏、前列腺、卵巢等。STC1的表达受不同发育阶段、生理和病理发展变化的调控，这一系列过程包括妊娠、泌乳、癌变、细胞凋亡和器官发生等。 本研究利用DENA诱导大鼠肝癌模型为实验材料，肝癌模型根据体重给予DENA水溶液70 mg/kg灌胃诱导建立，用以检测STC1基因和STC1在肝癌发生过程中的表达水平。每次灌胃前称量大鼠体重并记录用以后续分析；每次取材前称量大鼠体重和完整的肝重并记录用以计算肝体比值；测定DENA诱导组和对照组大鼠肝癌发生过程中组织和血清中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和γ-L-谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyltranspeptide，γ-GT)活力，辅助检测大鼠肝细胞癌变进程；采用半定量RT-PCR方法分析比较大鼠STC1基因mRNA在大鼠肝癌发生发展过程中的表达变化；采用Western blot技术检测并半定量分析STC1在大鼠肝癌发生发展过程中的分泌水平变化。 结果表明，DENA诱导组大鼠和对照组大鼠在多方面存在明显的差异，包括体重、肝体比值、ALP和γ-GT酶活、STC1基因mRNA表达水平和STC1分泌水平等。DENA诱导组大鼠自第5周起与同期对照组大鼠相比体重下降，并呈现显著性差异；然而，DENA诱导组大鼠肝体比值自第8周起高于同期对照组大鼠，并呈现显著性差异；肝脏癌变的病理学特征通过DENA诱导组大鼠肝脏的病理学切片观察得到；DENA诱导组大鼠肝组织和血清中ALP活力显著高于同期对照组大鼠，DENA诱导组大鼠肝组织和血清中γ-GT活力分别自第5周和第1周起显著高于同期对照组大鼠。RT-PCR和Westernblot技术分析表明，STC1 mRNA和STC1仅在DENA诱导组大鼠肝癌组织内才有表达。 总之，研究结果首次表明STC1 mRNA和STC1仅在DENA诱导组大鼠肝癌组织内表达，并且在一定程度上，STC1基因和STC1的表达与肝细胞癌变进程呈现相关性。因此，STC1有望成为监测人体肝细胞癌变的新型诊断分子标记物

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1前言

1.1鱼类STC的研究

1.1.1斯坦尼小体的发现

1.1.2鱼类STC分子结构

1.1.3鱼类STC基因表达模式

1.1.4鱼类STC的作用机制及调节

1.2哺乳类STC的研究

1.2.1哺乳类STC的发现

1.2.2哺乳类STC分子结构

1.2.3哺乳类STC的染色体定位和基因结构

1.2.4哺乳类STC1 mRNA和蛋白表达模式

1.2.5哺乳类STC的表达调控

1.2.6哺乳类STC与癌症的潜在关系

1.2.7哺乳类STC肿瘤发生发展中的作用前景

1.3本课题的立题依据、重要意义及研究方法

1.3.1立题依据和重要意义

1.3.2研究方法

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器设备

2.1.4试剂的配制

2.2大鼠肝癌模型的建立

2.3大鼠肝癌病理学切片的制备

2.3.1盖玻片和载玻片的处理

2.3.2肝脏取材

2.3.3病理学切片制作流程

2.4 DENA诱导大鼠肝癌过程中酶活的变化

2.4.1大鼠肝组织碱性磷酸酶(ALP)的测定

2.4.2大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)的测定

2.4.3大鼠肝组织γ-L-谷氨酰转肽酶(γ-GT)的测定

2.4.4大鼠血清γ-L-谷氨酰转肽酶(γ-GT)的测定

2.5大鼠肝组织总RNA提取

2.5.1实验用品的RNase-free处理

2.5.2 RNA提取操作步骤

2.5.3 RNA浓度和纯度检测

2.5.4 RNA完整性检测

2.5.5 RNA琼脂糖凝胶电泳上样量的分析

2.5.6 RNA的保存

2.6逆转录反应

2.6.1试剂的分装

2.6.2操作步骤

2.7大鼠肝组织STC1基因的PCR扩增

2.7.1试剂的分装

2.7.2 STC1引物序列

2.7.3 PCR操作步骤

2.7.4 PCR产物的电泳检测

2.8大鼠肝组织STC1的Western blot分析

2.8.1蛋白样品的处理

2.8.2配胶

2.8.3 SDS-PAGE电泳

2.8.4转膜

2.8.5封闭及杂交

2.8.6结合二抗

2.8.7洗涤

2.8.8显色拍照

3结果

3.1 DENA诱导大鼠肝癌发生过程中体视学方面的变化

3.1.1 DENA诱导肝癌发生对大鼠体重的影响

3.1.2 DENA诱导肝癌对大鼠肝体比的影响

3.1.3 DENA诱导的大鼠肝脏表观观察

3.1.4 DENA诱导的大鼠肝脏病理学变化

3.2 DENA诱导大鼠肝癌发生过程中生理生化方面的变化

3.2.1蛋白标准曲线

3.2.2大鼠肝组织和血清中ALP的变化

3.2.3大鼠肝组织和血清中γ-GT的变化

3.3总RNA的提取

3.3.1 RNA纯度和浓度的检测

3.3.2 RNA上样量与其琼脂糖凝胶电泳结果分析

3.3.3 RNA完整性检测

3.4大鼠肝脏STC1基因和内参GADPH基因PCR扩增结果

3.4.1大鼠肝脏STC1基因和GADPH基因PCR扩增结果

3.4.2大鼠肝脏STC1基因PCR扩增结果的半定量分析

3.5大鼠肝脏STC1和内参β-actin蛋白免疫印迹

3.5.1蛋白标准曲线

3.5.2 STC1在DENA诱导肝癌发生不同时期的水平变化

3.5.3大鼠肝脏STC1蛋白免疫印迹结果的半定量分析

4讨论

4.1大鼠肝癌模型的构建

4.2大鼠肝癌病变过程中肝脏的病理学变化

4.3大鼠肝癌病变过程中ALP和γ-GT活力的变化

4.3.1大鼠肝癌病变过程中ALP的变化

4.3.2大鼠肝癌病变过程中γ-GT的变化

4.4 RNA上样量与其完整性检测之间关系的分析

4.5大鼠肝组织STC1基因RT-PCR扩增分析

4.5.1 RT-PCR反应

4.5.2大鼠肝组织STC1 mRNA表达分析

4.5.3大鼠肝组织STC1表达分析

5结论

参考文献

致 谢

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