脂质运载蛋白2基因lcn在大鼠肝再生中作用研究

摘要

脂质运载蛋白2基因lcn2编码的小分子分泌型蛋白是脂质运载蛋白家族的成员之一,在细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程中起调节作用。为探讨lcn2过量或降低表达对肝脏再生的作用,本文以大鼠再生肝为材料,参照lcn2的mRNA序列信息设计克隆引物和带酶切位点引物,采用分子克隆技术得到lcn2的克隆载体,测序证实正确后，以其为模板，进一步将基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1上，构建出表达载体pEGFP-N1-lcn2；另外，同样参照lcn2的mRNA序列信息，利用锐博、Genesil、Ambion和QIAGEN等网站的在线设计工具，查阅siRNA设计相关论文，针对lcn2mRNA的2个区域合成寡聚核苷酸片段连接到干涉载体pGenesil-1.0上,构建出2个干涉lcn2mRNA的干涉载体pGenesil-1.0-l292和pGenesil-1.0-l616；酶切上述的表达载体pEGFP-N1-lcn2得到lcn2的ORF,将其连接到干涉载体pGenesil-1.0-l292和pGenesil-1.0-l616上,构建出干涉载体对应的检验载体pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-l.0-l616-lcn2。用尾静脉液压转基因法,分别将构建的表达载体pEGFP-N1-lcn2、干涉载体pGenesil-1.0-1292和pGenesil-1.0-1616及检验载体pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-1.0-l616-lcn2注入大鼠体内,用荧光显微技术观察肝组织的阳性细胞(数),并检测转lcn2后大鼠死亡率、肝指数、肝再生率和组织形态结构的变化。电泳和测序检测表明，本论文构建的lcn2的表达载体、干涉载体和检验载体正确，有生物学作用。荧光显微检测表明，pEGFP-N1-lcn2、pGenesil-1.0-l292和pGenesil-1.0-l616载体的绿色荧光蛋白基因的表达高峰为12h，pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-1.0-l616-lcn2载体的绿色荧光蛋白基因的表达高峰为6h。并且与对照载体pGenesil-1.0-hk-lcn2相比，检验载体pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-1.0-l616-lcn2的绿色荧光蛋白阳性细胞率比对照低5％左右，初步说明设计合成的两个干涉片段均有一定干涉作用。肝指数检测表明，在转基因后120和168h,转pEGFP-N1-lcn2载体组肝指数比对照和PH组小；在转基因后72、120和168h,转pGenesil-1.0-l616-lcn2载体组肝指数均比PH组略大。肝再生率检测表明,在转基因后120h，转pEGFP-N1-lcn2载体组肝再生率比PH组略大，但在转基因后168h却明显比PH组和对照组小:在转基因后120h，转pGenesil-1.0-l616载体组肝再生率几乎与对照和PH组重合，在168h比两组肝再生率大。总之，本文克隆了lcn2基因,构建其表达载体、干涉载体和检验载体,根据体内检测结果初步判断lcn2与大鼠肝脏再生相关。