共轭亚麻酸的氨基酸、多元醇修饰及其对氧化稳定性、细胞活性的影响

摘要

共轭亚麻酸(ConjugatedLinolenicacid，CLnA)是碳链长度为十八，含有一个共轭三烯体系的长链脂肪酸的总称，含有多种位置及几何异构体。由于具有抗癌、抗动脉粥样硬化、降血脂、降血糖、减肥、提高免疫力等非常有益的生理活性，被誉为“21世纪的新型营养因子”，引起了广泛的关注。目前科学家在共轭亚麻酸的合成、表征、分离分析、体内代谢、活性机理等方面已经取得了一系列重要的研究成果。
　　 但目前共轭亚麻酸的研究存在一突出问题，即其氧化稳定性极差，这大大影响了产业化。例如在50度的空气中，共轭亚麻酸仅需数小时即完全氧化。目前普遍采用的提高脂肪酸稳定性的方法主要有:与食用油脂混合、酯交换法、微囊化（包埋法）、环糊精包合、添加抗氧化剂等。但是这些方法在提高共轭亚麻酸稳定性方面，效果均欠佳。
　　 本论文采用目前较新的分子修饰法来提高共轭亚油酸的氧化稳定性。具体而言，我们选用氨基酸（包括三种极性氨基酸、非极性氨基酸）、双甘二肽、多元醇（山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇）作为修饰分子，对共轭亚麻酸进行了酰胺化以及酯化修饰，借此来提高共轭亚麻酸氧化稳定性。同时，共轭亚麻酸的活性机制目前仍不明确，许多研究认为可能和它的氧化情况密切相关。因此氧化稳定性的改变是否会影响到其活性，也是我们非常关心的一个问题。本研究以PC12细胞株作为体外模型，考察了经过修饰之后的CLnA衍生物对该细胞的胞质活性、形态、代谢等方面的变化。
　　 在本论文的第一章，我们对CLnA的结构、生理活性、合成方法以及常用的表征手段等进行了概述。接着重点概述了CLnA氧化稳定性的研究进展，包括其测试手段、氧化机制、提高氧化稳定性的方法、氧化与抗癌活性之间的复杂关系等。接着介绍了目前CLnA研究中存在的主要问题，并据此提出了本论文的研究目的和内容。
　　 第二章中我们选取了三种极性氨基酸，即甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸作为修饰分子，通过温和的DCC/DMAP缩合法，得到了三种极性氨基酸一共轭亚麻酸衍生物。UV、FT-IR、1H-NMR表明它们分别是甘氨酸酰胺化-CLnA、酪氨酸酰胺化-CLnA和赖氨酸-CLnA盐。氧化稳定性测试结果表明，相比于游离CLnA，这些衍生物的氧化稳定性大幅提高，其中尤以甘氨酸酰胺化-CLnA明显。此外衍生物在水中的分散性大大优于游离CLnA，透射电镜表明这些衍生物在水中呈纳米颗粒状或棒状。这些研究结果对于提高将来CLnA产品的保质期以及使用范围，都将是大为有利的。针对PC12细胞的体外模拟实验表明，上述衍生物在低浓度(4ug/mL)时对PC12细胞的细胞活性大为降低，而在高浓度(500ug/mL)时和游离CLnA基本一致。
　　 第三章我们采用三种非极性氨基酸，即丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸为修饰分子，经脱水缩合得到氨基酸-CLnA衍生物。UV、FT-IR、1HNMR结果表明他们分别是丙氨酸酰胺化-CLnA、亮氨酸酰胺化-CLnA、异亮氨酸酰胺化-CLnA。随后的氧化稳定性测试表明，它们的稳定性相比CLnA有所提高，但是幅度没有第二章中的极性氨基酸-CLnA衍生物明显。针对PC12细胞的体外模拟实验表明，上述衍生物在低浓度(4ug/mL)时对PC12细胞的细胞活性大为降低，而在高浓度(500ug/mL)时和游离CLnA基本一致。
　　 第四章我们以甘氨酸二肽作为修饰分子，合成到了甘氨酸二肽酰胺化-CLnA衍生物并进行了UV、FT-IR、1H-NMR表征。HRTEM、氧化稳定性测试结果表明该产物的分散性以及稳定性均有大幅度提高，且比极性氨基酸-CLnA、非极性氨基酸-CLnA的提高幅度要大。同时，该衍生物在低浓度下的细胞活性降低，而高浓度时和游离CLnA基本一致。
　　 第五章我们以三种多元醇分子，包括赤藓糖醇、木糖醇、山梨醇作为修饰分子，合成到了赤藓糖醇酯化-CLnA、木糖醇酯化-CLnA、山梨醇酯化-CLnA，并进行了UV、FT-IR、1H-NMR表征。HRTEM、氧化稳定性测试表明他们在水中的分散性以及稳定性均得到了极大提高。同时，该衍生物在低浓度下的细胞活性降低，而高浓度时和游离CLnA基本一致。
　　 总之，本研究采用氨基酸、多元醇类分子对游离CLnA进行了修饰，得到了一系列CLnA衍生物。这些衍生物均表现出了良好的氧化稳定性、水分散性。同时，这些衍生物低浓度下的细胞活性均出现降低，但高浓度时和游离CLnA基本一致。即修饰对CLnA原有的细胞活性影响不大。总之，本论文的研究结果对于提高将来CLnA产品的保质期、应用范围等均是非常有利的。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 共轭十八碳三烯酸简介

1．2 共轭十八碳三烯酸的制备

1．2．1 共轭十八碳三烯酸的天然提取法

1．2．2 共轭十八碳三烯酸的化学合成

1．2．3 共轭十八碳三烯酸的生物合成

1．3 共轭十八碳三烯酸的表征及分离分析方法

1．4 共轭十八碳三烯酸研究目前存在的问题

1．5 本论文的研究内容与创新性

1．5．1 研究内容

1．5．2 本论文的创新性

第二章 三种极性氨基酸-共轭亚麻酸衍生物的合成及其氧化稳定性、细胞活性变化

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 试剂与仪器

2．2．2 三种极性氨基酸-共轭亚麻酸衍生物的合成

2．2．3 三种极性氨基酸-共轭亚麻酸衍生物的紫外、红外光谱及核磁共振氢谱表征

2．2．4 三种极性氨基酸-共轭亚麻酸衍生物的氧化稳定性

2．2．5 透射电镜测试

2．2．6 PC12细胞的培养和种植

2．2．7 细胞活性的测定

2．2．8 细胞荧光分析

2．2．9 细胞扫描电镜(SEM)

2．3 结果与讨论

2．3．1 极性氨基酸-CLnA衍生物的分离纯化

2．3．2 UV表征

2．3．3 FTIR表征

2．3．4 1HNMR表征

2．3．5 三种极性氨基酸-CLnA衍生物的氧化稳定性

2．3．6 极性氨基酸-CLnA衍生物在水中的分散性及形态形貌

2．3．7 细胞活性研究

2．3．8 细胞的形态及分布

2．4 小结

第三章 非极性氨基酸-共轭亚麻酸衍生物的合成及其氧化稳定性、细胞活性变化

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 试剂与仪器

3．2．2 非极性氨基酸-共轭亚麻酸衍生物的合成

3．2．3 三种非极性氨基酸-共轭亚麻酸衍生物的紫外、红外光谱及核磁共振氢谱表征

3．2．4 三种非极性氨基酸-共轭亚麻酸衍生物的氧化稳定性

3．2．5 透射电镜测试

3．2．6 PC12细胞的培养和种植

3．2．7 细胞活性的测定

3．2．8 细胞荧光分析

3．2．9 细胞扫描电镜(SEM)

3．3 结果与讨论

3．3．1 非极性氨基酸-CLnA衍生物的分离

3．3．2 UV表征

3．3．3 FTIR表征与分析

3．3．4 1HNMR表征

3．3．5 HRTEM表征及其在水溶液中的分散性

3．3．6 三种非极性氨基酸-CLnA的氧化稳定性

3．3．7 细胞活性研究

3．3．8 细胞的形态及分布

3．4 小结

第四章 双甘二肽-共轭亚麻酸衍生物的合成及氧化稳定性、细胞活性的变化

4．1 引言

4．2 实验方法

4．2．1 试剂与仪器

4．2．2 双甘二肽-共轭亚麻酸衍生物的合成

4．2．3 双甘二肽-共轭亚麻酸衍生物的紫外、红外光谱及核磁共振氢谱表征

4．2．4 双甘二肽-共轭亚麻酸衍生物的氧化稳定性

4．2．5 透射电镜表征

4．2．6 PC12细胞的培养和种植

4．2．7 细胞活性的测定

4．2．8 细胞荧光分析

4．2．9 细胞扫描电镜(SEM)

4．3 结果与讨论

4．3．1 双甘二肽-CLnA衍生物的分离

4．3．2 UV表征

4．3．3 FTIR表征与分析

4．3．4 1HNMR表征

4．3．5 HRTEM表征及其在水中的分散性

4．3．6 氧化稳定性测试

4．3．7 细胞活性研究

4．3．8 细胞的形态及分布

4．4 小结

第五章 多元醇-共轭亚麻酸酯衍生物的合成、氧化稳定性及细胞活性的变化

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 试剂与仪器

5．2．2 三种多元醇酯化-共轭亚麻酸的合成

5．2．3 多元醇酯化-共轭亚麻酸衍生物的紫外、红外光谱及核磁共振氢谱表征

5．2．4 多元醇酯化-共轭亚麻酸衍生物的氧化稳定性

5．2．5 透射电镜测试

5．2．6 PC12细胞的培养和种植

5．2．7 细胞活性的测定

5．2．8 细胞荧光分析

5．2．9 细胞扫描电镜(SEM)

5．3 结果与讨论

5．3．1 CLnA各多元醇酯衍生物的分离

5．3．2 UV表征

5．3．3 FTIR表征与分析

5．3．4 1HNMR表征

5．3．5 HRTEM表征及其在水中的分散性

5．3．6 氧化稳定性变化

5．3．7 细胞活性研究

5．3．8 细胞的形态及分布

5．4 小结

参考文献

致谢

攻读硕士期间研究成果

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