水稻Rho GTP酶激活蛋白编码基因OsRhoGAP2功能的初步鉴定

摘要

已有研究显示，植物RhoGAP/RopGAP可能通过调节Rop蛋白来参与多种生物学过程。本实验室采用酵母双杂交技术，从水稻幼穗中分离得到一个与水稻Rho/Rop蛋白OsRacD相互作用蛋白的编码基因，命名为OsRhoGAP2，目前对该基因的研究尚未见报道。本研究从序列特征、亚细胞定位、激素对该基因表达的影响、启动子的克隆和序列缺失、过表达和RNA干扰技术鉴定该基因功能开展一系列的研究，旨在确定该基因的调控机制及其在水稻生长发育中的功能，为研究OsRacD与OsRhoGAP2的相互作用和功能联系奠定基础。
　　采用生物信息学分析，对OsRhoGAP2的基因结构、理化性质、编码蛋白的二级结构和亚细胞定位等特性进行了预测。结果显示，OsRhoGAP2位于2号染色体，由5个外显子和4个内含子组成。该基因cDNA全长1552bp，含有一个1320bp的读码框，编码439个氨基酸和1个终止密码子。蛋白序列中包括RhoGAP和CRIB保守结构域，属亲水蛋白，二级结构主要由α螺旋、β转角和无规则的螺旋组成。
　　为研究OsRhoGAP2的亚细胞定位，采用DNA重组技术，构建了与绿色荧光蛋白(eGFP)融合的pCAMBIA1302-OsRhoGAP2-eGFP载体，使其受控于CaMV35S强启动子。采用农杆菌侵染的方法，检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布，发现OsRhoGAP2-eGFP融合蛋白主要定位在细胞膜上。
　　为研究OsRhoGAP2基因的表达调控机制，通过水稻基因组序列数据库的检索和比对，确定了OsRhoGAP2基因翻译起点上游1912bp的启动子序列，采用植物启动子顺式元件数据库比对，对启动子的元件进行了预测和分析。结果显示，该基因的表达可能受到激素、高盐和干旱等非生物胁迫的调控。进而采用实时PCR技术检测了IAA、6-BA、GA、SA、MeJA、ABA等6种植物激素，以及高盐、干旱等非生物胁迫对该基因表达的影响，发现该基因在IAA、6-BA、GA、SA处理下，表达量均有2倍以上的提高。在MeJA和ABA激素的处理下，OsRhoGAP2基因的表达量变化幅度在2倍以内;而在干旱和盐等非生物胁迫处理过程中发现，OsRhoGAP2基因的表达量都在3h时达到最大值，然后逐渐恢复到正常水平。两类实验的共同提示，OsRhoGAP2的表达受到多种信号的调控。为进一步研究其表达调控机制，通过PCR介导的方法，克隆了该基因的启动子序列，并进行了序列缺失，分别构建了6个与GUS报告基因融合的系列启动子缺失植物表达载体，为进一步通过转基因技术鉴定该基因的表达调控机制奠定基础。
　　为了鉴定OsRhoGAP2基因的功能，采用了功能获得和功能缺失两种策略，分别构建了OsRhoGAP2基因的过表达植物载体以及RNA干扰植物表达载体，并通过农杆菌介导的方法转化水稻，获得了19棵T0代阳性过表达转基因植株。分子检测显示，重组基因已经整合到水稻基因组中，并实现了过表达。OsRhoGAP2基因干扰转基因植株的筛选正在进行当中。
　　本文通过一系列实验对OsRhoGAP2基因的序列特征、表达及调控机制以及功能进行了初步分析，为研究该基因在水稻生长发育中的功能，以及与OsRacD的功能联系奠定了基础。

目录

摘要

缩略语

第一章 转基因技术与水稻基因功能的研究

1．1 植物基因功能研究方法

1．1．1 RNAi技术

1．1．2 启动子与基因表达调控研究

1．2 转基因技术在水稻研究中的应用

1．2．1 研究转基因水稻的意义

1．2．2 水稻的转化方法

1．2．3 利用转基因技术提高水稻抗非生物胁迫的能力

1．2．4 利用转基因技术提高水稻抗生物胁迫的能力

1．2．5 转基因技术在水稻产量和品质改良上的应用

1．3 立题依据

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 质粒和菌株

2．1．3 引物设计合成

2．1．4 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 OsRhoGAP2基因编码蛋白的生物信息学预测

2．2．2 水稻OsRhoGAP2基因过表达植物载体的构建

2．2．3 OsRhoGAP2基因过表达转基因水稻的构建

2．2．4 水稻OsRhoGAP2蛋白的亚细胞定位研究

2．2．5 OsRhoGAP2基因的RNA干扰载体构建

2．2．6 OsRhoGAP2基因启动子的分析及缺失表达载体的构建

2．2．7 激素及非生物胁迫对OsRhoGAP2基因表达的影响

第三章 结果

3．1 OsRhoGAP2基因及其编码蛋白的序列分析

3．1．1 OsRhoGAP2基因的序列特征

3．1．2 OsRhoGAP2的理化特性及结构分析

3．2 水稻OsRhoGAP2基因植物过表达载体构建及遗传转化

3．2．1 OsRhoGAP2植物过表达载体构建

3．2．2 水稻的遗传转化和再生植株的培养

3．2．3 OsRhoGAP2基因过表达转基因水稻的鉴定

3．3 水稻OsRhoGAP2基因在洋葱表皮细胞中的定位

3．4 OsRhoGAP2基因RNA干扰载体构建

3．4．1 pENTR／D-OsRhoGAP2 gateway入门载体的构建

3．4．2 pANDA-OsRhoGAP2干扰载体的鉴定

3．5 OsRhoGAP2启动子元件预测和分析

3．6 OsRhoGAP2基因启动子缺失载体的构建

3．7 激素及非生物胁迫对OsRhoGAP2基因表达的影响

第四章 讨论

4．1 OsRhoGAP2是一个功能未知的水稻RhoGAP／RopGAP基因

4．2 OsRhoGAP2基因的表达受植物激素及非生物胁迫影响

4．3 OsRhoGAP2定位在细胞膜上

4．4 对OsRhoGAP2的功能鉴定具有重要意义

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文及参与的科研项目

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