水稻Rho GTP酶激活蛋白基因OsRhoGAP2及其启动子在分子育种上的应用潜力评估

摘要

水稻不仅是主要的粮食作物，同时也是重要的模式植物，对水稻相关农艺性状功能基因的鉴定意义重大。本实验室前期对水稻育性控制相关信号通路开展研究，通过酵母双杂交筛选，从水稻雌雄蕊形成期幼穗cDNA文库中分离到若干与Rho蛋白OsRacD相互作用蛋白的编码基因，其中包括一种Rho GTP酶激活蛋白基因，命名为OsRhoGAP2（GenBank登录号:AY364311）。本研究对该基因及其启动子开展系统的功能鉴定和元件分析，以此评估该基因在分子设计育种上的应用潜力。
　　基于本实验室前期构建的该基因启动子及5个5'端缺失片段载体，分别转化筛选拟南芥，每个转基因拟南芥均获得3个以上的纯合株系。通过GUS组织化学染色、酶活力测定结合缺失实验分析，研究不同启动子片段驱动GUS报告基因在生长发育不同阶段、不同组织中的表达，发现在OsRhoGAP2启动子5'端的-703bp～-289bp区域内可能着存在1个重要的花药特异性元件，驱动了GUS基因在转基因拟南芥的花药中表达，尤其是在小孢子发育的初期，而在成熟期时，拟南芥的营养器官（根、茎、叶）以及繁殖器官（果荚）中均没有表达，由此推测，OsRhoGAP2基因可能在小孢予发育初期表达，对维持花药正常发育有重要作用。通过5种激素(IAA、6-BA、GA、SA、MeJA)、5种胁迫处理（高温、低温、干旱、高盐、黑暗）对生长到10d的转基因拟南芥进行喷施处理，结合GUS染色，研究不同启动子片段对激素、非生物胁迫的响应，发现该基因启动子可能是1个与IAA诱导相关及胁迫诱导相关的启动子，在IAA及高温、干旱、高盐诱导条件下能驱动下游基因表达，而对其他激素没有响应。进一步推测，OsRhoGAP2基因可能参与到了IAA诱导相关及逆境胁迫诱导相关的应答过程。结合5'端的缺失实验表明，在该基因启动子的-1292 bp～-948 bp存在1个重要的MeJA响应元件，推测该基因可能参与了MeJA信号通路。
　　基于本实验室前期工作，本研究对OsRhoGAP2过表达转基因水稻T2代进行了分子检测和表型分析，旨在了解该基因在生产上的应用潜力。通过提取转基因水稻基因组DNA结合PCR扩增，对T2代转基因水稻进行检测，结果发现90％以上都是阳性植株;通过qRT-PCR检测，发现在T2代转基因水稻中，OsRhoGAP2基因表达量均在14倍以上，其中最高的达到了229倍;对T2代转基因水稻农艺学性状进行统计分析，结果发现，与野生型相比，其有效分蘖数有了显著提高，提高了32.35％-38.75％。提示在分子设计育种中，可以通过提高OsRhoGAP2基因的表达水平，增进水稻的有效分蘖数，进一步来提高水稻的产量。
　　本文对水稻Rho GTP酶激活蛋白基因OsRhoGAP2的研究显示，该基因启动子及其编码蛋白在分子设计育种上有重要的应用潜力。本研究发现该基因的启动子主要驱动报告基因在花药中表达，同时，该基因启动子对IAA及高温、干旱、高盐等非生物胁迫具有响应，可以应用于植物基因工程、植物品系改良、提高植物抗逆性等方面;同时，本研究的结果提示，该基因可以作为提高水稻有效分蘖的候选基因。

目录

摘要

缩略语

第一章 引言

1．1 启动子的定义

1．2 高等植物启动子的结构

1．2．1 TATA框

1．2．2 起始子

1．2．3 上游元件

1．2．4 应答元件

1．3．1 组成型启动子

1．3．2 组织特异性启动子

1．3．3 诱导型启动子

1．3．4 双向启动子

1．3．5 可变启动子

1．4 启动子的克隆

1．4．1 基因组文库筛选法

1．4．2 启动子探针筛选法

1．4．3 PCR技术克隆法

1．5．1 生物信息学分析法

1．5．2 实验分析法

1．6 启动子在植物基因工程中的应用

1．6．1 组成型启动子的应用

1．6．2 组织特异性启动子的应用

1．6．3 诱导型启动子的应用

1．6．4 人工启动子的应用

1．7 立题依据

第二章 实验材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料、菌株和载体

2．1．2 引物设计及合成

2．1．3 实验试剂和试剂盒

2．1．4 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 转基因拟南芥的构建

2．2．2 转基因拟南芥的GUS组织化学染色

2．2．3 转基因拟南芥幼苗期(10d)的GUS酶活测定

2．2．4 转基因拟南芥的激素及非生物胁迫处理

2．2．5 OsRhoGAP2过表达转基因水稻T2代的筛选

2．2．6 OE-OsRhoGAP2转基因水稻T2代的鉴定

2．2．7 农艺学性状统计

第三章 结果与分析

3．1 转基因拟南芥的筛选

3．1．1 转基因拟南芥阳性植株的初步筛选

3．1．2 转基因拟南芥的分子水平检测

3．1．3 转基因拟南芥纯合体的筛选

3．2 OsRhoGAP2启动子功能分析

3．2．1 OsRhoGAP2启动子的时空表达特性分析

3．2．2 OsRhoGAP2启动子对植物激素和非生物胁迫的响应分析

3．3 OsRhoGAP2过表达转基因水稻T2代的筛选和鉴定

3．4 OsRhoGAP2过表达转基因水稻T2代农艺学性状统计

第四章 讨论

4．1 长度为1912bp的OsRhoGAP2启动子可以驱动GUS报告基因在花药中表达

4．3 OsRhoGAP2基因的表达受IAA及高温、干旱、高盐的诱导

4．4 OsRhoGAP2启动子上存在着一个重要的MeJA响应元件

4．5 OsRhoGAP2基因的过量表达提高了水稻的有效分蘖数

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

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