丙型肝炎病毒抗体胶体金免疫层析法的初步建立

摘要

丙型肝炎是一种全球性流行的传染病，目前全球患病率约3％，约有1.8亿人感染丙型肝炎病毒(HepatisCVirus，HCV)，而高度慢性化是该病的最大特征。一般来说，急性HCV感染会显示亚临床状态，并导致慢性的肝脏疾病，患者常在无意识的情况下延误治疗，从而导致肝硬化和肝细胞癌的发生。目前国内尚无HCV抗病毒特效药物和相关疫苗。因此，控制HCV感染的形势十分严峻。目前主要靠早发现、早诊断和早治疗来防控HCV传染源、阻断传播途径，这对HCV的诊断提出较高要求。现在HCV的前期筛检主要为检测血清中的抗体，主要方法包括:酶联免疫法、聚合酶链反应、重组免疫印迹等。胶体金免疫层析方法与之相比，操作简单、携带方便、快速、特异，不需要任何设备和特殊试剂即可得到检测结果，特别适用于现场检测和诊断。
　　本课题基于胶体金的性质及免疫学原理，研制了一种能够快速诊断HCV抗体的胶体金免疫层析试纸条。即利用免疫胶体金技术，选择使用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，然后用其标记HCV重组抗原制备成金垫，同时将包被抗原与HCV单抗分别作为检测线与质控线蛋白包被硝酸纤维素膜，用于血清中HCV抗体的检测。
　　为制备出特异性、灵敏度、稳定性俱佳的试纸条，在研究过程中，充分考虑了各种影响因素对试纸条品质的影响。通过对胶体金制备用水、重组抗原的标记浓度、标记pH值、包被抗原抗体浓度、不同硝酸纤维素膜、不同湿度环境下对包被的影响、不同粒径大小的胶体金的灵敏度差异等因素进行摸索与探究，最终确定选择超纯水制备粒径大小约40nm的胶体金，标记蛋白浓度为20μg/mL，采用SartoriusstedimCN140无背衬膜在40％-60％的环境湿度下，质控线和检测线分别包被HCV单抗1mg/mL和HCV重组抗原1.5mg/mL，建立HCV胶体金双抗原夹心法。
　　对制备的试纸条进行特异性、灵敏度、稳定性等方面系统检测，并与ELISA检测方法进行临床比较。
　　结果表明该免疫胶体金试纸条特异性、灵敏度、稳定性较好，并方便、快捷，与ELISA法检测对比阳性率与阴性率俱佳。可用于丙肝病毒感染的早期诊断，具有一定的临床使用价值。

目录

摘要

引言

第一章 综述

1．1 丙肝概述

1．1．1 丙型肝炎病毒的形态结构

1．1．2 丙型肝炎病毒的生物学特性

1．1．3 丙型肝炎病毒的基因结构

1．1．4 丙型肝炎病毒感染的免疫学反应

1．1．5 丙型肝炎病毒的检测方法及其研究进展

1．2 免疫胶体金技术

1．2．1 胶体金技术简介

1．2．2 胶体金技术的基本原理

1．2．3 胶体金免疫层析方法

1．2．4 胶体金免疫检测技术的分类

1．2．5 胶体金免疫技术的特点

1．2．6 胶体金免疫层析技术的现状和发展

1．3 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 主要试剂与材料

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要溶液配制

2．2 方法

2．2．1 胶体金的制备

2．2．2 胶体金的鉴定

2．2．3 室内质控品的建立

2．2．4 抗原筛选及鉴定

2．2．5 反应模式的初步建立

2．2．6 免疫胶体金的制备

2．2．7 硝酸纤维素膜的选择

2．2．8 包被蛋白浓度的优化

2．2．9 环境湿度对包被的影响

2．2．10 试纸条的组装

2．2．11 试纸条的检测方法和结果判定

2．2．12 样品垫的选择与制备

2．2．13 试纸条灵敏度实验

2．2．14 胶体金粒径大小对灵敏度的影响

2．2．15 试纸条特异性实验

2．2．16 试纸条重复性试验

2．2．17 试纸条稳定性实验

2．2．18 胶体金稀释液的优化

2．2．19 胶体金试纸条与ELISA的比对试验

2．2．20 反应模式的最终确立

第三章 实验结果

3．1 胶体金的水质选择及鉴定

3．1．1 目测鉴定

3．1．2 紫外可见分光光度计鉴定

3．1．3 电镜分析结果

3．1．4 粒度分析结果

3．2 丙肝抗原鉴定

3．2．1 SDS-PAGE凝胶电泳结果

3．2．2 Western blot结果

3．2．3 初步标记包被抗原结果判定

3．3 免疫胶体金的制备

3．3．1 胶体金标记最佳pH的确定

3．3．2 胶体金标记最低蛋白浓度的确定

3．3．3 最佳金标稀释液加入量的优化

3．4 硝酸纤维素膜的选择

3．5 包被蛋白浓度的优化

3．5．1 检测T线的蛋白浓度优化

3．5．2 质控C线的蛋白浓度优化

3．6 环境湿度对包被的影响

3．7 样品垫的选择与制备

3．8 试纸条灵敏性实验

3．9 胶体金粒径大小对灵敏度的影响

3．10 试纸条特异性实验

3．11 试纸条重复性试验

3．12 试纸条稳定性实验

3．13 金标稀释液的优化

3．14 胶体金试纸条与ELISA的比对试验

3．15 反应模式的最终确立

第四章 讨论

4．1 胶体金的制备与鉴定

4．2 胶体金标记及包被的优化

4．3 硝酸纤维素膜的选择

4．4 稳定性

4．5 胶体金稀释液的优化

4．6 试纸条与ELISA的对比

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

符号与缩略语

致谢

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