草鱼脂肪肝相关基因和miRNAs的差异表达及mir-33的靶基因验证

摘要

集约化水产养殖模式下，养殖鱼类常出现肝脂质代谢紊乱等问题，作为世界上养殖产量较大的淡水鱼类，草鱼（Ctenopharyngodon idella）养殖普遍采用投喂配合饲料的精养模式，其营养需要及配方技术的研究虽已深入开展，但生产中仍经常出现与饲料有关的糖脂代谢失调及肝脂质代谢紊乱问题，已严重影响到草鱼品质。本研究以高糖高脂饲料诱导的草鱼脂肪肝为材料，通过高通量测序技术，筛选出差异表达的miRNAs;利用miRNAs预测软件，预测鱼类脂代谢特异miRNAs的靶基因;利用qRT-PCR技术检测草鱼脂代谢相关基因SREBP-1、PPARγ、ACC1、FAS、LPL、CPT-1的表达变化，并对筛选出的脂代谢相关miR-33的靶基因进行初步验证，以期阐明关键miRNAs调节草鱼肝脂代谢紊乱的作用机制。本研究从筛选调节肝脂代谢的关键miRNAs入手，探讨鱼类肝脏脂肪代谢的标志基因和miRNAs的差异变化，旨在丰富鱼类糖脂代谢理论，为提高草鱼脂代谢利用能力、防治脂肪肝等营养代谢疾病、促进草鱼健康养殖提供新的思路。
　　1、高糖高脂饲料诱导草鱼腊肪肝形成
　　为探讨投喂高糖高脂饲料对草鱼肝脏脂肪蓄积的影响，本研究设计了4种等氮但糖脂含量水平不等的饲料，对照组（糖含量31％，脂肪含量4％）、高脂组（糖含量31％，脂肪含量8％）、高糖组（糖含量45％，脂肪含量4％）和高糖高脂组（糖含量45％，脂肪含量8％），用试验饲料饲喂草鱼65天后，检测草鱼生长指标、饲料效率、蛋白质效率及肝脂含量，对草鱼是否形成脂肪肝进行初步判断。结果表明，草鱼在摄食高糖高脂饲料后，其生长性能、饲料效率、蛋白质效率与对照组相比无显著差异(P＞0.05);草鱼的肝体比(HSI)、脏体比(VSI)与对照组相比也无显著变化(P＞0.05);高糖高脂组的肠脂比(MFI)显著高于对照组(P＜0.05)，高糖组、高脂组与对照组之间无显著差异(P＞0.05);高糖组、高脂组和高糖高脂组的肝脂含量均显著高于对照组(P＜0.05)，说明高糖高脂饲料对草鱼生长影响不大，但引起了草鱼肝脏脂肪的大量蓄积。
　　用全自动生化分析仪(AU-640，OLYMPUS)检测血清中甘油三酯（Triglyceride，TG）、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)、球蛋白（Globulin, GLB）、总蛋白（Total protein, TP）等生化指标，结果发现在高糖高脂饲料诱导下，与对照组相比，AST/ALT、GLB、TP、TG等指标升高，说明肝脏功能已受到了一定影响，其中以高糖高脂组受到的损害最严重。
　　显微镜下观察肝脏组织学形态，结果发现，与对照组相比，高糖组、高脂组和高糖高脂组的肝细胞内脂滴明显增多，有的细胞肿大变形，说明高糖高脂诱导不仅导致了肝脏脂肪的大量蓄积，还可能引起了肝脏功能的部分损伤。
　　2、高通量测序技术筛选高糖高脂饲料诱导下差异表达的miRNAs
　　饲喂试验结束后，提取并分离草鱼肝脏小RNA，构建小RNA文库，采用Hiseq深度测序技术，筛选出高糖高脂诱导下差异表达的miRNAs。结果表明，与对照组相比，高糖组、高脂组、高糖高脂组分别有531、455和637个差异表达的miRNAs，并初步确定了18个新的miRNAs。
　　3、荧光定量检测高糖高脂对脂代谢基因和miRNAs表达的影响
　　以诱导的草鱼肝为材料，实时荧光定量技术检测6种脂代谢相关基因和3种miRNAs在不同处理下的表达量，结果显示，脂肪生成转录因子SREBP-1、PPARγ和脂肪生成酶基因ACC1、FAS的表达量均上调，脂蛋白脂酶基因LPL表达量也上调，脂肪氧化酶基因CPT-1表达量下调，说明高糖高脂诱导下，可引发脂代谢相关基因的表达响应。3种miRNAs(miR-33、miR-122、miR-370)的表达均显著上调，与高通量测序结果一致。推测miRNAs与糖脂代谢相关基因可能共同参与调节草鱼糖脂代谢过程。
　　4、草鱼SREBP-1基因的克隆及miR-33靶基因的预测
　　固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)是调控糖脂代谢相关基因表达的关键核转录因子。为获知草鱼SREBP-1基因的序列，本实验采用同源克隆和RACE的方法获得了草鱼SREBP-1的部分cDNA序列，并通过生物信息学方法对该基因及所编码蛋白的结构特征进行了分析;利用实时荧光定量PCR的方法，对SREBP-1在8种不同组织中的表达规律进行了研究，利用miRNAs预测软件预测了miRNAs在SREBP-13'非编码区的作用靶位点。结果显示:草鱼SREBP-1的cDNA长为4760 bp(GenBank登录号:KJ162572)，其中开放读码框为3426bp，编码1141个氨基酸;3'非编码区为1279bp;草鱼SREBP-1具有一个典型的碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链结构(bHLH-zip);氨基酸序列比对结果显示，草鱼SREBP-1与其他鱼类的同源性达到76％-88％之间，与斑马鱼的进化关系最近;草鱼SREBP-1基因在脑中的表达量最高，肝脏和肠次之，在脾脏、肾脏、脂肪、肌肉和性腺中均有少量表达;miRNAs靶基因预测结果显示，SREBP-1的YUTR区存在两种与脂代谢相关的miRNAs，即miR-33和miR-16。
　　5、SREBP-1基因3'-UTR双荧光素酶报告载体的构建
　　本研究成功构建了SREBP-13'UTR荧光素酶报告基因载体，并验证了SREBP-1YUTR区包含了miR-33的结合位点，是miR-33的候选靶基因。为下一步在细胞水平上对miR-33的功能和作用机理进行研究奠定了基础。

目录

摘要

缩略语中英文对照

第一章 前言

1．1 影响鱼类肝脏脂质蓄积的因素

1．1．1 营养因素

1．1．2 生理因素

1．1．3 物种因素

1．1．4 环境因素

1．1．5 遗传与突变

1．2 鱼类形成脂肪肝的分子机制

1．2．1 鱼类脂肪肝的鉴别

1．2．2 鱼类脂肪肝的发生机制

1．2．3 影响鱼类脂肪肝形成的关键基因

1．3 miRNAs在动物脂肪代谢中的研究概况

1．3．1 miRNAs的发现

1．3．2 miRNAs基本生物学特性、调控机制

1．3．3 miRNAs调控动物脂类代谢

1．4 本研究的目的及意义

第二章 高糖高脂饲料对草鱼生长及肝脏脂肪蓄积的影响

2．1 引言

2．2 材料

2．2．1 主要器具

2．2．2 主要试剂配制

2．3 方法

2．3．1 制作实验饲料

2．3．2 饲养与管理

2．3．3 样品采集与贮存

2．3．4 生长指标及生物学特征参数评价

2．3．5 血清生化指标的测定

2．3．6 肝脏组织石蜡切片的制作

2．4 结果与分析

2．4．1 高糖高脂饲料对草鱼生长及脂肪蓄积的影响

2．4．2 高糖高脂饲料对草鱼血清生化指标和肝脏组织的影响

2．5 讨论

第三章 高通量测序检测高糖高脂饲料对草鱼相关miRNAs表达的影响

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 制作实验饲料

3．2．2 饲养与管理

3．2．3 样品采集与贮存

3．2．4 提取样品总RNA

3．2．5 小RNA分离

3．3 结果与分析

3．3．1 肝脏总RNA提取结果

3．3．2 高通量测序小RNA长度分析结果

3．3．3 小RNA测序数据注释结果

3．3．4 肝脏已知miRNAs的鉴定与分析

3．3．5 miRNAs转录组测序的差异表达结果

3．4 讨论

第四章 高糖高脂饲料对草鱼脂肪代谢关键基因和miRNAs表达的影响

4．1 引言

4．2 主要试剂

4．3 方法

4．3．1 制作实验饲料

4．3．2 饲养与管理

4．3．3 样品采集与贮存

4．3．4 提取样品总RNA

4．3．5 第一链cDNA合成

4．3．6 脂代谢相关基因和miRNAs表达量的检测

4．3．7 数据统计与分析

4．4 结果与分析

4．4．1 标准曲线

4．4．2 高糖高脂饲料对草鱼脂肪代谢相关基因表达的影响

4．4．3 高糖高脂饲料对草鱼miRNAs表达的影响

4．5 讨论

第五章 草鱼SREBP-1基因的克隆和miRNA在其3’UTR区作用靶位点的预测

5．1 引言

5．2 材料

5．2．1 实验用鱼

5．2．2 主要试剂

5．2．3 试剂配制

5．2．4 主要仪器

5．3 方法

5．3．1 肝脏总RNA提取

5．3．2 第一链cDNA合成

5．3．3 SREBP-1 cDNA中间片段的合成

5．3．4 SREBP-1 cDNA 3’端基因克隆

5．3．5 序列分析

5．3．6 草鱼SREBP-1组织表达分析

5．3．7 预测草鱼SREBP-1 3’UTR区的miRNA作用靶位点

5．4 结果

5．4．1 草鱼SREBP-1核苷酸序列分析和氨基酸序列的一级结构

5．4．2 bHLH-zip结构域的二级结构及理化性质分析

5．4．3 氨基酸序列的系统进化树分析

5．4．4 草鱼SREBP-1基因组织表达分析

5．4．5 SREBP-1 3’UTR区miRNA作用靶位点的预测

5．5 讨论

第六章 SREBP-1基因3’UTR双荧光素酶报告载体的构建

6．1 引言

6．2 材料

6．2．1 实验鱼

6．2．2 主要试剂

6．2．3 主要仪器

6．3 方法

6．3．1 肝脏总RNA提取

6．3．2 靶基因SREBP-1 3’UTR的扩增

6．3．3 靶基因SREBP-1 3’UTR荧光素酶报告基因载体的构建

6．3．4 miR-33 mimics的合成

6．3．5 双荧光素酶表达载体和miR-33 mimics共转染细胞系验证候选靶基因

6．4 结果与分析

6．4．1 靶基因SREBP-1 3’UTR的扩增结果

6．4．2 靶基因SREBP-1 3’UTR荧光素酶报告基因载体的构建

6．4．3 双荧光素酶表达载体转染C2C12细胞验证候选靶基因

6．5 讨论

总结与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间学术业绩

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