表没食子儿茶素没食子酸酯对白介素-4诱导的小鼠M2型巨噬细胞标志性因子表达的影响

摘要

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，与炎症、宿主防御、创伤修复等密切相关，多样性和可塑性是其两大特点。根据激活后的活化状态和发挥功能的不同分为经典激活型巨噬细胞(M1型)和替代激活型巨噬细胞(M2型)。M1型巨噬细胞由TLR配体和IFN-γ共同刺激产生，其代表的是一种促炎表型，能清除入侵病原体，促进Th1型免疫反应，产生IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、iNOS等促炎因子。而M2型巨噬细胞是一种抗炎表型，参与机体众多疾病的免疫及病理生理过程，与病原微生物感染、肿瘤、超敏反应性疾病及创伤愈合等多种疾病有相关性，具有调控组织修复和重塑，促进Th2型免疫反应的功能;基于诱导剂和标志性分子表达的不同分为M2a、M2b、M2c和M2d，而M2a是典型的M2型巨噬细胞，由IL-4/IL-13刺激产生，分泌抵抗素样分子α(Fizz-1)、精氨酸酶-1(Arg-1)、小鼠几丁质酶3类蛋白3(Ym-1)、IL-10等抗炎标志性因子。
　　目前研究已经证实，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate)是绿茶中最有效的抗氧化多酚，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、减肥等多种生物活性。近年来，IL-4/IL-13分别与IL-4Rα和IL-13Rα受体结合，通过激活STAT-6的磷酸化导致巨噬细胞M2型标志因子(Mrc-1、Fizz-1、Ym-1、Arg-1)上调的相关信号通路研究的较为清楚。但是，EGCG能否影响IL-4刺激的巨噬细胞M2型标志性因子的表达，目前无人研究，其相关的信号通路也不清楚。因此，为了考察EGCG对IL-4诱导的巨噬细胞M2型标志因子表达的影响，本课题选取了Arg-1、Ym-1、Fizz-1、iNOS。
　　本课题采用IL-4诱导小鼠巨噬细胞使其产生M2型巨噬细胞的模型。采用Raw264.7和小鼠腹腔巨噬细胞两种细胞材料。根据本实验室先前的研究，EGCG选用12.5μM、25μM和50μM三个处理浓度，IL-4选用20 ng/mL作为处理浓度。实验分为六组，分别是空白对照组、IL-4处理组、EGCG处理组、三个浓度梯度的EGCG和IL-4共处理组。采用EGCG预处理2小时，IL-4(20 ng/mL)处理24小时，分别采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和实时荧光定量(qRT-PCR)检测Arg-1、Ym-1、Fizz-1和iNOS的蛋白水平和mRNA水平。结果表明，20 ng/mL IL-4和50μM EGCG单独刺激小鼠巨噬细胞与空白对照组相比均可显著促进Arg-1、Ym-1、Fizz-1在mRNA和蛋白水平上的表达，抑制iNOS在mRNA和蛋白水平上的表达。三个不同浓度EGCG(12.5μM～50μM)和IL-4共处理组与IL-4处理组相比，Arg-1、Ym-1、Fizz-1基因的mRNA相对表达量和蛋白含量显著升高，且随着EGCG浓度的增大，其mRNA相对表达量和蛋白含量逐渐升高，具有剂量依赖性。但iNOS的表达随着EGCG浓度的增大，抑制作用逐渐增强，也具有剂量依赖性。通过本实验的研究发现，EGCG可以促进M2型标志性因子(Arg-1、Ym-1、Fizz-1)的表达，抑制M1型(iNOS)的表达。推断EGCG可能与巨噬细胞极化有关，但是具体的调控机制需要进一步研究加以阐明。

目录

摘要

缩略词表

文献综述

1．1 巨噬细胞

1．1．1 巨噬细胞极化研究现状

1．1．2 巨噬细胞极化的分子机制研究现状

1．1．3 M2型巨噬细胞极化与炎症相关疾病的关系

1．2 表没食子儿茶素-3-没食子酸酯

1．2．1 表没食子儿茶素-3-没食子酸酯简介

1．2．2 表没食子儿茶素-3-没食子酸酯与炎症的关系

第一章 引言

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验所用小鼠及细胞

2．1．2 实验所用药品及试剂

2．1．3 试剂的配制

2．1．4 主要仪器设备

2．2 RAW264．7细胞系的培养、处理与检测实验

2．2．1 RAW264．7细胞系的复苏

2．2．2 RAW264．7细胞系的传代

2．2．3 RAW264．7细胞系冻存

2．2．4 MTT法检测细胞系增殖

2．2．5 RAW264．7细胞系加药与制备待测样品

2．2．6 实时荧光定量PCR检测

2．2．7 ELISA检测

2．3 小鼠腹腔巨噬细胞的培养、处理与检测实验

2．3．1 小鼠腹腔巨噬细胞的培养

2．3．2 细胞加药与制备待测样品

2．3．3 小鼠腹腔巨噬细胞实时荧光定量PCR检测

2．3．4 小鼠腹腔巨噬细胞ELISA检测

第三章 结果

3．1 MTT实验结果

3．1．1 EGCG对RAW264．7细胞系增殖的浓度效应

3．1．2 EGCG对RAW264．7细胞系增殖的时间效应

3．2 RAW264．7细胞实验的检测结果

3．2．1 不同浓度IL-4对RAW264．7细胞系Arg-1表达的影响

3．2．2 不同浓度IL-4对RAW264．7细胞系iNOS表达的影响

3．2．3 Ym-1的Real-Time PCR和ELISA的检测结果

3．2．4 Arg-1的Real-Time PCR和ELISA的检测结果

3．2．5 Fizz-1的Real-Time PCR和ELISA的检测结果

3．2．6 iNOS的Real-Time PCR和ELISA的检测结果

3．3 小鼠腹腔巨噬细胞实验的检测结果

3．3．1 Ym-1的Real-Time PCR和ELISA的检测结果

3．3．2 Arg-1的Real-Time PCR和ELISA的检测结果

3．3．3 Fizz-1的Real-Time PCR和ELISA的检测结果

3．3．4 iNOS的Real-Time PCR和ELISA的检测结果

第四章 讨论

4．1 EGCG对IL-4诱导的小鼠巨噬细胞ARG-1、YM-1、FIZZ-1表达的影响

4．2 EGCG对IL-4刺激的小鼠巨噬细胞iNOS表达的影响

第五章 结论

参考文献

致谢

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