表没食子儿茶素没食子酸酯对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞炎症相关因子表达的影响

摘要

表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是绿茶多酚中儿茶素的主要成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，其中针对EGCG的化学预防和抗炎活性研究已经成为热点。有关EGCG化学预防作用的研究已经通过细胞实验，动物实验和临床实验获得了一些成果。目前很多体外实验已证明EGCG对细胞内多种信号通路具有调控作用，这些通路包括JAK/STAT、MAPK、PI3K/AKT、Wnt、Notch、NF-κB和AP-1。EGCG通过抑制各种转录因子来调节细胞内各种炎症相关因子的表达，这些转录因子包括Sp1、NF-κB、AP-1、STAT1、STAT3和FoxO1。近些年研究表明，EGCG对巨噬细胞产生的多种促炎因子表达具有抑制作用，但这一作用的分子机制还不是完全清楚。目前研究表明，EGCG通过结合巨噬细胞表面相应的67LR，来下调巨噬细胞炎性因子的表达，从而达到抗炎消炎的作用。然而，巨噬细胞作为生物体内重要的免疫细胞，其极化与炎症的发生发展有着密切的联系。不同表型的巨噬细胞对炎症的作用也是不同的。M1型巨噬细胞介导炎症反应，促进炎症发生，能够分泌TNF-α、IL-1β、NO等促炎因子。M1型巨噬细胞以高表达iNOS为标志;M2型巨噬细胞对炎症具有抑制作用，在组织损伤修复和纤维化中具有重要作用。M2型巨噬细胞以高表达Arg-1为标志。因此为了考察EGCG对巨噬细胞表型的影响，本课题选取了iNOS和Arg-1两种炎症相关酶来检测。另外，本课题还选取了在炎症反应中有重要作用的ICAM-1和VCAM-1两种粘附分子来进行检测。
　　本课题采用LPS诱导的小鼠巨噬细胞作为炎症模型。所用细胞分别选取小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系和原代小鼠腹腔巨噬细胞。根据本课题组之前对RAW264.7细胞炎症模型的研究结果来确定实验方案。实验采用EGCG预处理2h，处理浓度分别为12.5μM、25μM和50μM，同时设立空白处理和LPS(1μg/ml)处理作为对照，然后再用LPS(1μg/ml)处理24h后取材检测。用实时荧光定量PCR检测iNOS、Arg-1、ICAM-1和VCAM-1的mRNA水平，并用ELISA检测四种因子蛋白的表达量。实验结果表明，LPS处理可使iNOS、Arg-1、ICAM-1和VCAM-1基因表达量升高。经过EGCG预处理后，LPS诱导的小鼠巨噬细胞中iNOS、Arg-1、ICAM-1和VCAM-1的基因表达量相比LPS组，在mRNA水平和蛋白水平都有所下降。并且，四种因子的表达量随着EGCG预处理浓度的增大，呈现下降趋势。这表明EGCG(12.5～50μM)预处理能明显抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞系和原代小鼠腹腔巨噬细胞中iNOS、Arg-1、ICAM-1、VCAM-1基因的表达。这种抑制作用是在基因转录水平上的。EGCG预处理对四种因子表达的抑制作用随着EGCG浓度的增大而逐渐增强。因此，在12.5～50μM的浓度范围EGCG对LPS诱导的小鼠巨噬细胞四种炎症相关因子表达的抑制作用存在剂量依赖性。根据本课题研究结果中iNOS和Arg-1两种标志物的表达情况，同时根据已有的相关研究报道，可以说明EGCG（12.5～50μM）预处理能够抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞向M1型极化。本课题的研究结果为今后进一步阐明EGCG的炎症预防机制提供了理论依据。

目录

摘要

缩略词表

第一章 引言

1．1 研究背景

1．1．1 EGCG的抗炎研究现状

1．1．2 巨噬细胞极化与炎症的关系

1．1．3 iNOS和Arg-1与炎症的关系

1．1．4 ICAM-1和VCAM-1与炎症的关系

1．2 研究意义及实验设计

1．2．1 研究目的和意义

1．2．2 实验设计

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验细胞及小鼠

2．1．2 实验主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．2 RAW264．7细胞系的培养、处理与检测实验

2．2．1 RAW264．7细胞系的培养

2．2．2 药物处理与待测样品制备

2．2．3 实时荧光定量PCR检测

2．2．3 ELISA检测

2．3 小鼠腹腔巨噬细胞的提取、处理与检测实验

2．3．1 小鼠腹腔巨噬细胞的提取

2．3．2 药物处理与待测样品制备

2．3．3 实时荧光定量PCR检测

2．3．4 ELISA检测

第三章 结果

3．1 RAW264．7细胞实验的检测结果

3．1．1 RAW264．7细胞iNOS的实时荧光定量PCR和ELISA的检测结果

3．1．2 RAW264．7细胞Arg-1的实时荧光定量PCR和ELISA的检测结果

3．1．3 RAW264．7细胞ICAM-1的实时荧光定量PCR和ELISA的检测结果

3．1．4 RAW264．7细胞VCAM-1的实时荧光定量PCR和ELISA的检测结果

3．2 小鼠腹腔巨噬细胞实验的检测结果

3．2．1 小鼠腹腔巨噬细胞iNOS的实时荧光定量PCR和ELISA的检测结果

3．2．2 小鼠腹腔巨噬细胞Arg-1的实时荧光定量PCR和ELISA的检测结果

3．2．3 小鼠腹腔巨噬细胞ICAM-1的实时荧光定量PCR和ELISA的检测结果

3．2．4 小鼠腹腔巨噬细胞VCAM-1的实时荧光定量PCR和ELISA的检测结果

第四章 讨论

4．1 EGCG对LPS诱导的小鼠巨噬细胞表达iNOS和Arg-1的影响

4．2 EGCG对LPS诱导的小鼠巨噬细胞表达ICAM-1和VCAM-1的影响

4．3 EGCG调控作用的分子机制探讨

4．6 EGCG对巨噬细胞极化的影响

4．6 EGCG的化学预防作用探讨

4．7 EGCG的应用前景探讨

第五章 结论

参考文献

致谢

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