日本沼虾表皮蛋白基因的克隆及分析

摘要

甲壳动物有着坚硬的表皮，也被称为外骨骼，作用是维持其物种特异性形态，保护并使之与外部环境隔离。甲壳动物通过周期性脱去旧的表皮产生新表皮来进行生长发育。表皮主要由几丁质、蛋白质与碳酸钙构成，表皮蛋白(cuticle proteins，CPs)与几丁质结合形成纤维骨架控制表皮的钙化，对新表皮的形成起到极其重要的作用。本实验室前期研究发现，咪唑类物质KK-42能显著缩短日本沼虾（Macrobrachium nipponense）幼虾的蜕皮周期，推测CPs可能是其作用的靶分子。CPs作为主要的结构性蛋白，理论上，其表达水平及其表达的时序性改变会影响表皮的厚度，进而影响蜕皮周期的进程。本实验以实验室前期转录组测序为基础，通过NCBI Conserved Domain Search筛选含chitin_ bind_4结构域的目标基因，采用qRT-PCR技术定量研究相关基因的时空表达及KK-42处理后基因表达的变化，分析它们与蜕皮周期之间的联系，为阐明KK-42缩短日本沼虾蜕皮周期的机制积累资料。将500尾体长3.0±0.5 cm的日本沼虾分为实验组和对照组，实验组用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液浸泡1 min，对照组用不含KK-42溶液处理。于处理后0、3、6、12、24和48h，取处于C、D0-2、D3-4和A期的尾扇、腹肢和步足表皮提取mRNA，用于后续研究。
　　本研究主要内容包括：⑴根据实验室发现CPs基因的先后顺序，将筛选出的3个基因分别命名为MnCP-6、MnCP-7和MnCP-8，已在NCBI GENEBANK数据库注册，注册号分别为KY399478、KY3399479和KY411918。通过测序发现长度分别为373 bp、759 bp和1183 bp。经NCBIBlastx比对，MnCP-6与端足虫(hyalella azteca，XP_018010163.1)相似性为70％，使用CutProtFam-Pred推测为编码RR-2家族蛋白; MnCP-7与端足虫(Hyalellaazteca，XP_018010157.1)相似性为73％，推测同属于RR-2家族。MnCP-8与豌豆长管蚜(acyrthosiphon pisum，XP_001950806.2)相似性为43％。⑵上述3个MnCPs的转录水平在蜕皮周期的不同阶段以及不同的表皮组织呈现明显的差异。以尾扇中表达量为参照，在C期、D0-2期以及D3-4期，步足MnCP-6表达量＞腹肢; A期，步足中表达量＜腹肢。MnCP-7在C期与A期表达情况类似，腹肢中表达＜步足;在D0-2期各组织内表达水平相当;D3-4期步足表达量最高。在C期、D0-2期和D3-4期，步足MnCP-8表达最高;A期，腹肢中表达量最大。⑶KK-42处理可显著上调上述3个基因的表达，其中，尾扇MnCP-6基因在C、D3-4期被诱导的表达量显著升高;步足MnCP-7基因表达量在C期升高，至D0-2期呈下降趋势;在D3-4和A期，腹肢中MnCP-8表达呈先升高后降低的趋势。

目录

摘要

缩略语表

第一章 前言

1．1 甲壳动物表皮的作用、构成及其在蜕皮周期中变化

1．1．1 甲壳动物表皮的生理作用

1．1．2 甲壳动物的表皮构成

1．1．3 表皮结构在蜕皮周期中的变化

1．2 甲壳动物表皮蛋白的研究进展

1．2．1 表皮蛋白家族与结构特点

1．2．2 表皮蛋白的功能

1．3 研究的目的和意义

1．3．2 研究目的与意义

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物及处理

2．1．2 主要试剂

2．1．3 试剂配置

2．1．4 实验仪器设备及部分耗材

2．2 实验方法

2．2．1 RNA的提取

2．2．2 RNA完整性和纯度的检测

2．2．3 cDNA的合成

2．2．4 日本沼虾表皮蛋白基因的克隆

2．2．5 表皮蛋白基因的时空表达

第三章 结果

3．1 日本沼虾总RNA提取结果

3．2 日本沼虾表皮蛋白基因克隆与序列分析

3．3 MnCPs基因的时空表达分析

3．3．1 MnCPs基因的组织表达

3．3．2 MnCPs在蜕皮周期中的表达变化

3．4 KK-42对MnCPs基因表达的影响

第四章 讨论

第五章 结论

第六章 创新性

参考文献

致谢

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