日本沼虾表皮几丁质结合蛋白基因的克隆及分析

摘要

甲壳动物体表被覆的坚硬表皮具有保护作用的同时也限制其生长，但可通过周期性蜕皮克服这一弊端。几丁质结合蛋白(chitin-binding proteins，CBPs)作为甲壳动物表皮的主要成分，与蜕皮过程中新表皮的形成密切相关，有关日本沼虾CBPs(Macrobrachiumnipponense chitin-binding proteins，MnCBPs)尚未见报道。本实验室前期研究发现，咪唑类物质KK-42能明显缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的时程，显著增加蜕皮前晚期内表皮厚度，提示:MnCBPs的表达水平及其表达的时序性特征可能是影响蜕皮周期时程的关键因素之一。本文首次从日本沼虾步足表皮组织内克隆出5条MnCBPs基因的部分cDNA片段，并采用Real-time PCR技术研究了MnCBPs基因的时空表达规律及KK-42处理缩短了蜕皮周期之后MnCBPs基因表达的变化，据此确定MnCBPs与蜕皮周期之间可能的联系，为阐明KK-42缩短日本沼虾蜕皮周期的机制积累资料。
　　选取体长3.0±0.5 cm的健康日本沼虾600尾，分为2组:实验组和对照组，其中，实验组用1.95×10-4 mol/L的KK-42溶液浸泡处理1 min，迅速控除水分后，立刻投入到水族箱中，按正常方式饲养;对照组用不含KK-42溶液做相同的处理。从KK-42处理后0、3、6、12、24和48h的实验组和对照组中，分别提取处于C、D0-2和D3-4期的步足表皮、胃肠和肝胰腺的RNA，用于基因表达的研究，结果如下:
　　从步足表皮组织内克隆出5条MnCBPs基因的部分cDNA片段，分别命名为MnCBP-1、MnCBP-2、MnCBP-3、MnCBP-4和MnCBP-5，测序分别为1396bp、624 bp、378 bp、834bp和403 bp，Genebank登录号为KU316937、KU356775、KU356774、KU306737和KU356773。生物信息学分析表明，均含有几丁质结合_4结构域(chitin_bind_4)，经在线BLAST比对，MnCBP-1与蚤状潘(Daphnia pulex, EFX71650.1)相似性为44％，MnCBP-2与克氏原螯虾(Procambarus clarkia, BAM99303.1)相似性为62％，MnCBP-3与克氏原螯虾(BAF73806.1)相似性为75％，MnCBP-4与日本囊对虾(Penaeus japonicas，BAA90875.1)相似性为48％，MnCBP-5与丰年虾(Artemia franciscana，ABS19965.1)相似性为48％。
　　Real-time PCR结果表明:步足表皮组织内，MnCBP-1和MnCBP-5基因表达量随着蜕皮前期的开始持续增加，而MnCBP-2、MnCBP-3和MnCBP-4这3个基因的表达水平，相较C期，均在D0-2期显著降低，但在D3-4期又显著升高;肝胰腺内MnCBPs基因转录物均随蜕皮前期的开始逐渐增加;在蜕皮周期不同阶段，胃肠内MnCBP-1、MnCBP-2、MnCBP-3和MnCBP-5基因的表达水平虽有一定的波动，但基本上无统计学意义上的显著性变化，而MnCBP-4几乎不表达。KK-42处理后，上述基因在不同组织的表达特征不尽相同:蜕皮前期幼虾步足表皮组织内5个MnCBPs基因的表达被显著诱导，肝胰腺内5个MnCBPs基因表达水平总体呈下降趋势，胃肠内5个MnCBPs基因的表达量在蜕皮周期不同阶段有所上升。结果表明，步足表皮组织内，5个MnCBPs基因表达水平的变化与蜕皮周期有关，KK-42处理显著诱导这5个基因表达。

目录

摘要

缩略语表

第一章 前言

1 甲壳动物表皮结构和成分在蜕皮周期中的变化

1．1 蜕皮周期及其调节

1．2 表皮结构及其在蜕皮周期中的变化

1．3 表皮成分及其在蜕皮周期中的变化

2 甲壳动物CBPs的研究进展

2．1 节肢动物CPs的种类及其命名

2．2 CBPs的种类及结构

2．3 CBPs的功能

2．4 蜕皮激寨对CBPs表达的调节作用

3 CBPs的研究展望

4 研究目的与意义

第二章 材料和方法

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 主要试剂

1．3 试剂配置

1．4 实验仪器设备

2 实验方法

2．1 总RNA的提取

2．2 RNA检测

2．3 cDNA第一链的合成

2．4 日本沼虾几丁质结合蛋白基因的克隆及表达

第三章 结果

1 日本沼虾总RNA的提取

2 日本沼虾CBPs基因的克隆及序列分析

3 MnCBPs基因的时空表达分析

3．1 MnCBPs基因的组织表达

3．2 MnCBPs基因的蜕皮周期表达

4 KK-42对MnCBPs基因表达的影响

4．1 KK-42对MnCBP-1基因表达的影响

4．2 KK-42对MnCBP-2基因表达的影响

4．3 KK-42对MnCBP-3基因表达的影响

4．4 KK-42对MnCBP-4基因表达的影响

4．5 KK-42对MnCBP-5基因表达的影响

第四章 讨论

第五章 结论

第六章 创新性

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间参加的科研项目和发表的论文

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