椭圆小球藻NF-YA/B/C基因克隆与功能研究及Fe2+对椭圆小球藻油脂合成的影响

摘要

藻类被认为是最有前途的生物燃料的来源之一。随着食用油及生物柴油的需求不断增长，寻找新的、潜在的高产和可持续性的油脂生产原料迫在眉睫。在油料作物中过表达与油脂合成相关的转录因子增加油含量是一种可行的方法。椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea）生长迅速，低氮条件下培养可大量积累油脂。NF-Y是对种子发育、油脂合成和积累有重要影响的转录因子。我们试图从椭圆小球藻中克隆NF-Y基因并在拟南芥菜中鉴定其功能，为油料作物如油菜改良，提高油菜的含油量，提供技术和理论基础。
　　本研究以椭圆小球藻为实验材料，克隆了3个基因NF-YA（CeNF-YA）、NF-YB（CeNF-YB）和NF-YC(CeNF-YC)。对CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC的氨基酸序列与人类、酵母、老鼠、拟南芥、水稻、油菜等物种的序列进行比对分析，发现保守结构域序列相似性分别为56.6％-71.7％、62.9％-91.4％、35.1％-93.5％。我们将这3个基因分别构建到酵母表达载体pYDEST02上，然后在酵母INVSc1中表达，发现这3个基因在酵母中能够表达，但是转基因酵母的总脂肪酸含量没有发生明显变化。我们将Ce NF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC在拟南芥中异源表达，得到T1代种子，发现拟南芥转基因株系的千粒重比野生型Col-0分别提高了26.5％-44.9％，24.5％-51％，18.4％-44.9％;转基因株系脂肪酸含量比野生型Col-0分别提高了22.4％-18.4％，7.1％-11.2％，9.8％-15.4％，并且脂肪酸的组成变化不大，其中主要脂肪酸成分含量变化比较大的是C18∶0、C18∶1、C18∶3、C20∶1;转CeNF-YA、CeNF-YB、Ce NF-YC植株与Col-0相比C18∶0分别提高了14.5％-24.4％，12.2％-24.5％，1.9％-28％;C18∶1分别提高了10.5％-31.0％，10.8％-29.9％，1.1％-7.9％;C18∶3分别提高了27.2％-35.2％，3.5％-6.4％，22.6％-28.5％; C20∶1分别提高了27.4％-34.8％，6.5％-20.6％，7.6％-16.0％。除此之外，我们为了进一步研究CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC的作用机制，对CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC进行了亚细胞定位，发现它们均定位在细胞核。对CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC互作实验发现，CeNF-YA与CeNF-YB、CeNF-YB与CeNF-YC有互作。研究了不同浓度的Fe2+对椭圆小球藻生长、油脂积累及对油脂合成相关基因表达的影响。结果发现高浓度Fe2+促进椭圆小球藻的生长。在缺Fe2+条件下有利于脂肪酸的积累，并且CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC的表达量上调，CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC的表达有助于脂肪酸含量的提高。

目录

摘要

缩略词表格

第一章 文献综述

1．1 微藻油脂合成与调控的生化及基因工程研究进展

1．1．1 生理生化调节

1．1．2 微藻油脂代谢的基因工程

1．1．3 展望

1．2 转录因子NF-Y研究概况

1．2．2 LEC1型转录因子的研究

1．3 研究目的与意义

1．4 技术路线

第二章 椭圆小球藻NF-YA／B／C基因克隆与功能研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 植物材料

2．2．2 菌株和质粒

2．2．3 工具酶和生化试剂

2．2．4 主要仪器设备

2．2．5 抗生素的制备

2．2．6 培养基制备

2．3 实验方法

2．3．1 椭圆小球藻的培养

2．3．2 椭圆小球藻总RNA的提取

2．3．3 椭圆小球藻cDNA的合成

2．3．4 椭圆小球藻NF-YA、NF-YB和NF-YC的克隆

2．3．5 扩增产物连接到中间载体

2．3．6 热激转化大肠杆菌

2．3．7 重组克隆的鉴定、保存

2．3．8 质粒提取

2．3．9 基因序列分析及进化树的构建

2．3．10 椭圆小球藻CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC在酵母中的功能验证

2．3．11 椭圆小球藻CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC基因在拟南芥中的鉴定

2．3．12 椭圆小球藻CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC基因在烟草细胞中的亚细胞定位

2．3．13 用双分子荧光互补实验验证椭圆小球藻CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC之间的互作

2．4 结果与分析

2．4．2 椭圆小球藻CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC的生物信息学分析

2．4．3 椭圆小球藻CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC在酵母(INVSc1)中的功能鉴定

2．4．4 CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC在拟南芥中的功能鉴定

2．4．5 转基因油菜阳性植株的鉴定

2．4．6 椭圆小球藻pHZM27-CeNF-YA、pHZM27-CeNF-YB和pHZM27-CeNF-YC蛋白的亚细胞定位

2．4．7 椭圆小球藻CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC蛋白之间的互作

2．5 讨论

2．5．2 椭圆小球藻CeNF-YA、CeNF-YB和CeNF-YC功能及其应用潜力探讨

2．6 结论

第三章 不同浓度Fe2+对椭圆小球藻油脂积累及与油脂合成相关关键基因的表达的影响

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 植物材料

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 椭圆小球藻不同浓度Fe2+处理

3．3．2 对不同浓度Fe2+处理的椭圆小球藻生长曲线的测定

3．3．3 椭圆小球藻总脂肪酸含量的测定

3．3．4 实时荧光定量PCR检测不同处理下相关基因的表达

3．4 结果与分析

3．4．2 不同浓度Fe2+处理椭圆小球藻脂肪酸成分测定与分析

3．4．3 不同浓度Fe2+处理下油脂代谢过程中相关基因的表达情况

3．5 讨论

3．5．1 Fe2+对椭圆小球藻生长状况的影响

3．5．2 Fe2+对椭圆小球藻油脂积累的影响

3．5．3 Fe2+对椭圆小球藻油脂积累相关基因表达情况分析

3．6 结论

参考文献

附录

致谢

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