Cu2+、Fe2+胁迫诱导小球藻富集油脂及调控机制

摘要

随着化石燃料的不断消耗和环境问题的日益严重，寻找清洁可再生的能源迫在眉睫。生物柴油作为一种无毒的环境友好型能源逐渐受到人们的青睐。微藻在异养培养条件下可以获得较高的生物量和油脂含量，但是由于生物量和油脂量的积累是在不同的生长阶段，因此油脂产量并没有真正提高。研究表明金属离子诱导可以有效提高微藻油脂产率，使微藻生物产油的工业化生产得以实现。本文考察了铜、铁离子诱导条件下油脂积累兴奋效应及其调控机制。具体内容和结果如下：
　　（1）Cu2+诱导培养条件下，最大生物量和油脂产率分别为6.47 g/L和5.78 g/L。GC-MS分析表明，微藻胞内几乎所有脂肪酸均为C15-C20的脂肪酸，符合生物柴油生产标准。蛋白质组学分析成功鉴定出30种表达变化的蛋白质点。KEGG Automatic Annotation Server ver.1.64a分析显示，这些蛋白主要参与了12种生物学过程。其中，7种蛋白，包括磷酸丙糖异构酶（A75）、转醛醇酶2（A107）、烯醇化酶（A133）、pfkB碳水化合物激酶（A144）、葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶（B9）、糖苷水解酶（B30）和葡萄糖-6-磷酸异构酶（B92）参与了碳水化合物代谢。一种表达上调的蛋白，核酮糖二磷酸羧化酶（A89）与卡尔文循环有关。表达上调的蛋白3-羟烷基-[酰基载体蛋白]-脱氢酶（A12）、甘油-3-磷酸酰基转移酶（A25）和乙酰辅酶A结合蛋白（A134）参与了油脂代谢过程。表达下调的蛋白苹果酸脱氢酶（D26和D105）和琥珀酰辅酶A合酶α亚基（B108）参与了TCA循环。一种表达上调蛋白肽基-脯氨酰基顺反异构酶（A58）和两种表达下调蛋白从属ATP Clp蛋白水解酶（46）和60S核糖体蛋白L5（B59）参与了蛋白质代谢，包括蛋白质的合成、降解和折叠。五种表达上调的蛋白和生物学过程中的调节和转运有关，如激酶相似蛋白（A01和A34）、酪蛋白激酶1（A138）、ATP合酶α亚基（A126）和核苷转移酶（A37）。两种表达下调的蛋白，包括DNA控制的RNA聚合酶β亚基（B83）和依附于RNA的RNA聚合酶（B42）参与了RNA的合成。一种表达上调的蛋白5’-核苷酸酶主导蛋白（A42），两种表达下调的蛋白肌苷-5-单磷酸脱氢酶（B122）和腺甘酸激酶（B91）与核苷酸代谢有关。另外，核苷二磷酸激酶（B61）和超氧化物歧化酶（B62）分别与ATP的合成和活性氧清除有关。
　　（2）Fe2+诱导培养条件下，小球藻胞内最大油脂含量达到62％，此时油脂产率为820.17 mg/L/d。GC-MS分析结果表明，微藻胞内90％的脂肪酸为16:0,18:1Δ9和18:2Δ9,12。DIGE定量分析成功鉴定出31种变化的蛋白质点。这些蛋白质点按照分子功能分为9类，即碳水化合物代谢、油脂合成、卡尔文循环、细胞呼吸、光合作用、能量和传递、蛋白质合成、调节和防御以及未归类的。其中表达下调的3-磷酸莽草酸-1-羧乙烯基转移酶（L19）参与了碳水化合物代谢；三种表达上调的蛋白3-氧化酰基-[酰基载体蛋白]合酶（H44）、S-酰基转移酶（H16）和苹果酸酶（H09）与油脂合成有关；一种表达上调的蛋白，核酮糖二磷酸羧化酶（H22）参与了卡尔文循环；两种表达上调的蛋白细胞色素c生源论蛋白（H33）和细胞色素 b6-f复合物铁-硫亚基（H37）与细胞呼吸和光合作用有关；三种表达上调的ATP合酶（H12、H14、H15）和一种表达下调的ATP从属HADH水化物脱水酶（L36）负责能量与转运；五种表达上调的蛋白，延长因子（H08）、60S核糖体蛋白L37a（H17）、腺苷高半胱氨酸酶（H23）、线粒体GTP酶（H47）和40S核糖体蛋白S27（H88）参与了蛋白质的合成过程；六种表达上调的蛋白，蛋白酶β亚基（H10）、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（H28）、V型H+ATP酶A亚基（H48）、微管蛋白β链（H06）、热休克蛋白70B（H01）和伴侣流出家族蛋白（H19）与胞内调节和抵御过程有关。
　　Cu2+、Fe2+诱导条件下，小球藻细胞内苹果酸脱氢酶、ATP合酶、核酮糖二磷酸羧化酶、核糖体蛋白的表达丰度均发生变化，这为遗传基因工程构建高产油脂工程微藻提供理论基础。

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第1章 绪论

1.1生物柴油

1.1.1 生物柴油制备

1.1.2 生物柴油特点

1.2 生物柴油生产原料

1.2.1 第一代生物柴油原料

1.2.2 第二代生物柴油原料

1.2.3 第三代生物柴油原料

1.3 微藻生物柴油

1.3.1 微藻生物柴油的优势

1.3.2 高产油脂微藻筛选

1.3.3 微藻生物柴油加工简介

1.4 影响微藻生物量和油脂量的因素

1.4.1 培养模式

1.4.2 营养元素

1.5 微藻胞内油脂积累途径及机制概述

第2章 Cu2+诱导对小球藻细胞生物量和油脂积累的影响

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1实验材料

2.2.2 实验方法

2.2.3 生物指标分析方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 Cu2+诱导对小球藻细胞生物量和油脂积累的影响

2.3.2 Cu2+诱导条件下小球藻生物形态学分析

2.3.3 Cu2+诱导对小球藻细胞脂肪酸成分的影响

2.3.4 Cu2+诱导条件下小球藻胞内蛋白质鉴定及分类

2.3.5 Cu2+诱导条件下小球藻胞内油脂代谢路径分析

2.4 本章小结

第3章 Fe2+诱导对小球藻细胞生物量和油脂积累的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1实验材料

3.2.2实验方法

3.2.3 生物指标分析方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 Fe2+诱导对小球藻生物量和油脂积累的影响

3.3.2 Fe2+诱导对小球藻脂肪酸成分和生物柴油性质的影响

3.3.3 Fe2+诱导小球藻胞内差异蛋白质鉴定及生物信息学分析

3.3.4 Fe2+诱导小球藻胞内油脂合成代谢分析

3.4 本章小结

结论与展望

结论

创新点

展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文及研究成果