声明
致谢
摘要
第一章文献综述
1.1植物中山梨醇的研究
1.2山梨醇在植物中的分布
1.3山梨醇在植物体内的功能
1.3.1是蔷薇科植物主要的光合产物和同化运输物质
1.3.2是蔷薇科植物主要的代谢贮藏物质
1.3.3山梨醇在植物体内的积累可提高植物的抗逆性
1.4山梨醇代谢相关酶的研究进展
1.4.1 6-磷酸山梨醇脱氢酶(sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)
1.4.2醛糖-6-磷酸还原酶(alditol-6-phosphate reductase,A6PRD)
1.4.3山梨醇-6-磷酸磷酸脂酶(sorbitol-6-phosphate phosphatase,S6PPP)
1.4.4山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase,SDH)
1.4.5山梨醇氧化酶(sorbitoloxidase,SOX)
1.5 S6PDH与SDH基因的克隆及其转基因植物的研究进展
1.5.1 S6PDH基因的克隆及同源性分析
1.5.2 SDH基因的克隆及序列分析
1.5.3 S6PDH与SDH基因的植物遗传转化研究
1.6本研究的目的和意义
第二章烟草山梨醇脱氢酶基因(NAD-SDH)的克隆与序列分析
2.1植物材料和菌株
2.2实验方法
2.2.1烟草叶片总RNA的提取
2.2.2烟草NAD-SDH全长CDNA的克隆
2.2.3 PCR产物的回收、连接和转化
2.2.4阳性克隆的筛选鉴定
2.3结果与分析
2.3.1烟草NAD-SDH的克隆
2.3.2烟草NAD-SDH与其它植物山梨醇脱氢酶氨基酸序列比较
2.4小结与讨论
第三章NAD-SDH-MBP融合蛋白的原核表达
3.1菌株和原核表达载体
3.2方法
3.2.1烟草NAD-SDH编码区CDNA序列的扩增
3.2.2回收产物NAD-SDH与PMD-18TSIMPLE载体的连接、转化和鉴定
3.2.3原核表达载体PMAL-C2X+SDH(简称pMAL-C2X+SDH)的构建
3.2.4 NAD-SDH-MBP融合蛋白的原核表达
3.2.5 SDS-PGAE电泳(J.萨姆布鲁克,《分子克隆实验指南》)
3.3结果与分析
3.3.1原核表达载体PMAL-C2X+SDH的构建
3.3.2 NAD-SDH-MBP融合蛋白的原核表达
3.4小结与讨论
第四章烟草NAD-SDH蛋白的亚细胞定位
4.1植物材料
4.2瞬时表达载体E3025-GFP的构建(PSAT6-RFP-N1载体的改造)
4.2.1瞬时表达载体E3025-GFP的构建
4.2.2洋葱表皮细胞瞬时表达(基因枪法)
4.3烟草NAD-SDH-GFP融合蛋白亚细胞定位
4.3.1瞬时表达载体E3025-GFP+NAD-SDH的构建
4.3.2 NAD-SDH-GFP融合蛋白的亚细胞定位
4.4结果与分析
4.4.1 PSATS-RFP-N1载体的改造
4.5.2利用E3025-GFP在洋葱表皮细胞瞬时表达GFP
4.5.3烟草NAD-SDH-GFP融合蛋白亚细胞定位
4.6讨论
第五章拟南芥T-DNA敲除NAD-SDH纯合突变体的鉴定
5.1植物材料
5.2方法
5.2.1拟南芥的种植
5.2.2拟南芥NAD-SDH基因T-DNA敲除突变纯合体的鉴定
5.3结果与分析
5.3讨论
第六章NAD-SDH植物表达载体的构建和转基因拟南芥的获得
6.1材料
6.2实验方法
6.2.1植物表达载体的构建
6.2.2拟南芥遗传转化
6.2.3转基因拟南芥的筛选鉴定
6.2.4转基因拟南芥和T-DNA敲除NAD-SDH突变纯合体拟南芥表型观察与初步抗旱试验
6.3结果与讨论
6.3.1植物表达载体P1302+SDH的成功构建
6.3.2植物表达载体P1305.1+SDH的成功构建
6.3.3重组质粒p1305.1+SDH和P1302+SDH的农杆菌转化结果
6.3.4转基因拟南芥的筛选
6.3.5转基因拟南芥的PCR验证
6.3.6转基因拟南芥和T-DNA敲除NAD-SDH突变纯合体拟南芥的表型观察与初步抗旱试验
第七章 小结
参考文献
附录