小球藻NADP-谷氨酸脱氢酶的cDNA克隆及转基因烟草分析(英文)

摘要

用RT_PCR方法从小球藻 (Chlorellasorokiniana)中克隆了铵诱导表达的以辅酶Ⅱ为辅基的谷氨酸脱氢酶(NADP_GDH)基因的cDNA片段 ,DNA测序分析表明与已报道的该基因cDNA序列同源性为 94%。将NADP_GDH基因先插入到SPDK6 2 1质粒的 2CaMV35S启动子和Ω增强序列之后 ,然后将 2CaMV35S_Ω_GDH_NOS表达单元构建到RokⅡ质粒的HindⅢ与EcoRⅠ之间 ,从而获得高效植物表达载体。将RokⅡ_GDH质粒转移到根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)EHA10 5中 ,对烟草 (NicotianatabacumL .)进行转化并得到阳性转化后代。对转基因烟草分析表明 ,在低氮培养基或在低氮蛭石中其生长速度和叶片数明显高于对照 ;铵毒性实验表明 ,无论在低铵或高铵条件下 ,接种在MS固化培养基上的转基因绿叶圆片存活时间长 ,叶绿素含量高。这些结果说明外源NADP_GDH增强了植物对氮素的吸收和利用。另外 ,转化后代还表现了对除草剂膦化麦黄酮 (PPT)具有较强的抗性 ;培养在含有不同浓度PPT的MS固化培养基上的转基因绿叶圆片 ,其愈伤化程度明显高于对照 ;在MS培养基中用 0 .5 μg/mL的PPT可以代替卡那霉素对转化后代进行筛选 ,这暗示NADP_GDH基因可以作为一种新的选择标记用于植物基因工程的研究。