猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株HNyc15的感染性克隆构建与鉴定

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染引起的一种严重危害世界养猪业的传染性疾病。2012年开始，从我国养猪场分离到一类与2008年在美国分离到的美洲型NADC30毒株有很高的核苷酸相似度的PRRSV毒株，最近几年这类毒株在我国养猪场广泛发现，在我国命名为PRRSV类NADC30毒株。该类毒株具有中等致病力，有研究表明现有的商品化疫苗已经不能提供完全的保护，对我国养猪业造成一定的经济损失。因此，分析该类毒株的遗传演化及分子致病机理具有重要的意义。本论文在对PRRSV类NADC30毒株HNyc15分离鉴定的基础上，进行了分离毒株的全基因组序列测定和进化分析，以期探究该类毒株的变异规律;利用反向遗传操作技术，构建了类NADC30毒株HNyc15的感染性克隆，以期为开展该类毒株致病机理、变异机制等相关研究奠定基础。
　　本研究对河南伊川猪场的血清样品进行PRRSV检测，检测结果显示为PRRSV阳性，且分型检测初步表明其为类NADC30毒株;利用猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages，PAM)进行病毒分离，接种PAM细胞后48h可观察到典型的细胞病变，96h收获细胞培养物;对其做RT-PCR，扩增Nsp2基因片段进行序列测定，Nsp2基因测序结果比对显示，与NADC30毒株Nsp2区域有着相同的131个氨基酸缺失。因此，确定为类NADC30毒株，命名为HNyc15株。
　　本研究根据Genbank上公布的NADC30毒株的全基因序列设计引物，对HNyc15毒株的全基因序列分为12段扩增，将各段基因序列测定结果进行拼接，基于国内外已有毒株的全基因组序列进行比对分析、遗传进化分析、重组分析。全基因序列测定表明，HNyc15毒株基因组全长为15049bp;与已报道的毒株全基因序列对比发现，HNyc15株与LV株、VR-2332株、NADC30株的核苷酸一致性分别为60.4％、85.2％、93.8％;进化分析表明，HNyc15、HENAN-XINX、HNjz15、HENAN-HEB、NADC30属于同一亚群，该亚群大多是由2012年之后在笔者分离到的类NADC30毒株所组成;软件分析重组情况表明，HNyc15株在ORF2-4区域重组了VR-2332和CH-1a的基因片段。由此推断，我国的类NADC30毒株可能是由美国NADC30株与美洲型毒株经历基因重组和逐渐积累变异而来的。
　　本研究将PRRSV类NADC30毒株HNyc15基因组根据合适的酶切位点分为A、B、C、D、E、F六个片段，设计引物分段扩增，将扩增后的产物插入中间载体pEASY-Blunt simple构建中间质粒;在pBluescriptⅡSK(+)载体多克隆位点(MCS)的上游插入CMV真核启动子，下游引入用于提高转染效率的丁型肝炎病毒的核酶因子(HDV)及BGH终止信号序列，改造出转录载体pBlue-CMV-HB;利用各片段两端的单一酶切位点将六个片段连入改造后的转录载体pBlue-CMV-HB中构建全长cDNA克隆质粒pBlue-CMV-HNyc15，并在B、C片段连接处通过同义突变引入酶切位点XbaⅠ，作为感染性克隆的遗传标记。转染BHK-21细胞，48h后收获细胞培养上清接种PAM细胞，接种后48h可在显微镜下观察到明显的细胞病变。通过IPMA鉴定表明病毒拯救成功，酶切鉴定遗传标记存在于拯救病毒。比较亲本病毒与拯救病毒的多步生长曲线，表明HNyc15拯救病毒与其亲本病毒在PAM细胞上的增殖特性没有显著差异。以上结果表明PRRSV类NADC30毒株HNyc15株感染性克隆构建成功，为研究PRRSV类NADC30毒株的分子生物学以及致病机制提供了技术平台。

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致谢

摘要

英文缩略表

第一章 文献综述

1．1 猪繁殖与呼吸综合征及其病毒研究进展

1．1．1 PRRSV病原学

1．1．2 PRRSV编码蛋白的结构和功能

1．1．3 PRRSV流行病学

1．1．4 PRRSV的遗传变异

1．1．5 临床症状及致病机理

1．1．6 防控策略

1．2．1 PRRSV反向遗传学概述

1．2．2 PRRSV感染性cDNA克隆的应用

第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒HNyc15株的分离与鉴定

2．2．2 方法

2．3 结果与分析

2．3．1 血清样品的PCR检测

2．3．2 PRRSV的分离

2．3．3 Nsp2基因序列的拼接及氨基酸同源性分析

2．4 讨论

第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒HNyc15株全基因序列测定与分析

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 材料

3．2．2 方法

3．3 结果与分析

3．3．1 PRRSV全基因组扩增、克隆、测序与序列拼接

3．3．2 HNyc15毒株全基因序列同源性分析

3．3．4 HNyc15毒株基因重组分析

3．4 讨论

第四章 猪繁殖与呼吸综合征病毒HNyc15株感染性克隆的构建及鉴定

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料

4．2．2 方法

4．3 结果与分析

4．3．3 HNyc15株全长cDNA质粒的拼接与测序

4．3．4 病毒拯救

4．3．6 PRRSV HNyc15株拯救病毒的生物学特性

4．4 讨论

第五章 结论

参考文献