类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒FJZ03株感染性克隆的构建及鉴定

摘要

为构建类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)FJZ03株的感染性克隆,本研究将该株病毒全基因组分成6段,通过同义突变将其中的A14378G,引入了Mlu I酶切位点为分子标记.经RT-PCR分别扩增后,克隆至改造后的载体pSK中构建中间质粒.经测序鉴定各质粒正确后,分段连接至pSK中构建全长cDNA克隆质粒pSK-FJZ03.将鉴定正确的pSK-FJZ03转染Marc-145细胞并传代,收集出现CPE后的病毒液,经RT-PCR扩增后的产物经Mlu I酶切和测序鉴定;同时采用激光共聚焦试验鉴定,获得的拯救病毒命名为RvFJZ03.分别测定RvFJZ03在Marc-145细胞与潴肺泡巨噬细胞(PAMs)中的生长曲线,比较拯救病毒与亲本病毒的生长特性.将获得的拯救病毒RvFJZ03在Marc-145细胞中连续传代,对不同代次的重组病毒分别测定病毒效价,并经RT-PCR扩增后通过Mlu I酶切和测序鉴定.测序鉴定结果表明,正确构建了感染性克隆质粒pSK-FJZ03;将其转染Marc-145细胞后并传至第3代出现典型CPE,经激光共聚焦试验、RT-PCR及测序鉴定表明拯救了重组病毒RvFJZ03.不同代次拯救病毒的病毒效价在105.5 TCID50/mL～107.0 TCID50/mL,且不同代次的拯救病毒均能够检测到Mlu I酶切位点.病毒的生长曲线结果显示,拯救病毒RvFJZ03与其亲本病毒在Marc-145和PAMs中的生长曲线相似.本研究构建了FJZ03株感染性克隆,并拯救了重组病毒RvFJZ03,该拯救病毒能够稳定传代并稳定遗传Mlu I分子标记且与亲本病毒的生长特性一致.本研究为探究该类病毒的致病机制提供了技术平台.