猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株的分离鉴定、全基因序列测定及分析

摘要

本研究旨在对类NADC30毒株进行病毒分离和全基因组测序，了解类NADC30毒株的分子特征和遗传进化情况，对类NADC30毒株进行深入的研究。同时对河南及周边地区流行的PRRSV毒株的ORF5及nsp2的基因变异情况进行检测，揭示PRRSV毒株的最新流行动态，以期为临床诊断、新疫苗的研发及抗病毒药物的研发提供科学的参考依据。
　　一、PRRSV分型PCR方法的建立
　　为了更快捷准确地对类NADC30毒株进行检测，本实验针对PRRSV类NADC30毒株、HP-PRRSV毒株、经典PRRSV毒株在nsp2区域分别缺失131个氨基酸、30个氨基酸无缺失这一分子特征，设计一对引物建立PCR方法对这3类毒株进行分型。本实验完成该RT-PCR方法的建立，及敏感性和特异性的验证，并对临床样品进行检测。实验结果证明:该方法能够同时将经典PRRSV毒株、HP-PRRSV毒株以及类NADC30毒株这三种类型的毒株进行区分，并具有良好的敏感性和特异性。
　　二、对2016-2017年河南省及周边地区的PRRSV的分子检测，及ORF5、nsp2基因的变异分析
　　本研究对756份临床样品进行RT-PCR检测，共检出阳性样品139份，阳性率18.4％，扩增得到42个nsp2序列和50个GP5序列，遗传进化表明，河南地区的流行株主要为美洲型毒株，其中有20份与NADC30毒株高度同源，且在nsp2区域有131个氨基酸的不连续缺失。其余的22份序列与HP-PRRSV高度同源，均在nsp2区域有30个氨基酸的不连续缺失。与2016年相比，2017年河南及周边地区类NADC30毒株的比例急剧增加，且PRRSV流行毒株的GP5和nsp2均发生了很大的变异，因此有必要对PRRSV流行和变异进行持续的检测，以期为临床诊断和疫病防控提供科学的参考依据。
　　三、20株类NADC30样品的分离与鉴定
　　对检测为类NADC30的样品接种PAM细胞进行病毒分离，共分离获得20株类NADC30毒株，RT-PCR鉴定结果表明分离到的毒株均能扩增出目的条带，IPMA鉴定结果表明分离到的样品均PRRSV阳性。
　　四、PRRSV类NADC30毒株全基因序列测定及分析
　　本研究获得了20株类NADC30毒株的全基因序列，并对其进行遗传进化分析及同源性分析。分析结果显示:20株全基因组核苷酸之间的同源性86.8％-93.8％，与VR2332的同源性为85.1％-88.2％，与CH-1a的同源性为84.2％-90.8％，与NADC30的同源性为88.3％-96.7％，与JXA1的同源性为83.5％-93.0％。遗传进化表明，19株毒株属于第5亚型，1株属于第4亚型。对20株毒株进行重组分析结果表明19株发生重组，1株未发生重组，重组位置多发生在非结构蛋白，重组毒株以HP-PRRSV毒株为主。本研究为深入研究类NADC30毒株在中国的变异和遗传进化提供了参考。

目录

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致谢

摘要

英文缩略表

第一章 文献综述

1．1．2 抗原性

1．1．3 体外培养特性

1．1．4 病毒基因组结构特征

1．1．5 病毒主要编码的蛋白

1．2 流行病学

1．3 PRRSV的致病机理

1．4 我国PRRSV的变异演化及其分子机制

1．5 PRRSV的诊断与检测技术

1．5．1 血清学诊断方法

1．5．2 分子生物学诊断方法

1．6 猪繁殖与呼吸综合征疫苗

1．6．1 灭活疫苗

1．6．2 减毒活疫苗

1．6．3 DNA疫苗

1．6．4 亚单位疫苗

1．6．5 活载体疫苗

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 材料

2．2．2 方法

2．3 结果与分析

2．3．3 RT-PCR鉴别检测方法的特异性实验结果

2．3．5 分型RT-PCR临床样品检测结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 2016-2017年河南省及周边部分地区PRRSV分子检测及nsp2、ORF5基因变异分析

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料

3．2．2 方法

3．3 结果与分析

3．3．1 病原检测结果

3．3．2 nsp2及ORF5的扩增结果

3．3．3 nsp2基因的变异特征

3．3．4 ORF5基因的变异特征

3．4 讨论

3．5 小结

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料

4．2．2 方法

4．3 结果与分析

4．3．1 PRRSV分离培养结果

4．3．2 PRRSV的分离病毒的检测

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株全基因序列测定与分析

5．1 引言

5．2 材料和方法

5．2．1 材料

5．2．2 方法

5．3 结果与分析

5．3．1 全基因扩增

5．3．2 同源性分析

5．3．3 20株类NADC30毒株的全基因序列遗传进化分析

5．3．4 类NADC30毒株基因重组分析

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 结论

参考文献