四季秋海棠叶片转录组测序分析和低温诱导花色素苷合成机理

摘要

花色素苷是使植物体组织呈现红至紫色的主要物质，常因各种环境胁迫诱导而在植物叶片上合成积累，因而具有植物逆境胁迫的“指示剂”之称。通过转录组测序技术的发展，我们可以深入探究低温诱导和高光诱导的花色素苷合成机制中的差别部分和相同部分。本研究以四季秋海棠‘超级奥林匹克’为研究材料，对不同条件下(正常生长条件CK、高光条件HL和低温条件LT)四季秋海棠叶片进行转录组测序。并从转录组测序的数据中发现，低温在诱导花色素苷合成相关的基因(PAL、4CL、CHS、F3H、ANS和3GT)表达的同时，BsRbohD基因(Rboh家族的其他基因没有变化)也应激显著上调。因此用生物信息学方法对其cDNA序列及推测氨基酸序列进了行分析。对低温和不同处理下BsRbohD基因进行qRT-PCR分析。研究结果如下:
　　(1)转录组测序共获得21.09Gb Clean Data，各样品Clean Data均达到6.73Gb，Q30碱基百分比在92.10％及以上。低温处理和高光处理分别获得74，779和83，699条unigene，其平均长度分别684pb和640pb。低温组转录组测序中transcript和unigene的N50值分别为2，200和1，249pb，高光组转录组测序中transcript和unigene的N50值分别为2，113和1，098pb。进行基于Unigene库的基因结构分析，其中SSR分析共获得6，567个SSR标记，同时还进行了CDS预测和SNP分析;分别通过5个蛋白质数据库(Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO数据库)对基因进行功能注释，共获得54，799条Unigene的注释结果，并发现:低温和高光均诱导次生代谢途径的转录因子和合成基因上调表达，但是二者作用的机理并不尽相同:低温通过碳代谢到氨基酸生物途径到苯丙素生物合成进入花色素苷合成途径，而高光是通过蛋白质生物合成至类黄酮生物合成途径再到花色素苷合成途径;高光主要诱导次生代谢途径中的花色素苷合成，而低温在诱导花色素苷合成的同时也诱导了木质素和原花色素(proanthocyanidins)的合成。两组转录组数据中的差异基因涉及花色素苷生物合成、转移运输和调控等方面的生物过程。本研究是第一次对秋海棠进行大规模基因表达的检测。
　　(2)BsRbohD基因在低温处理3h后即开始显著上调表达，并于第9h达到高峰;而几个关键的花色素苷合成基因(BsPAL、BsCHS、BsF3H和BsANS)则分别在低温处理5h、7h、7h和9h后开始显著上调，并于第9h达到最高峰。初步表明BsRbohD基因介导的H2O2的信号作用可能介入了低温引起的花色素苷合成过程。
　　(3)分别用H2O2、MV、低温下施加NADPH氧化酶的底物NADPH、NADPH氧化酶的抑制剂DPI、H2O2的清除剂DMTU等处理四季秋海棠叶片，结果表明:低温、H2O2、MV处理显著促进了植物体内H2O2含量和O2产生速率，同时BsRbohD、BsPAL、BsCHS、BsF3H和BsANS基因的表达显著上调，最终导致积累了显著的、肉眼可见的花色素苷;低温下施加NADPH氧化酶的底物NADPH加剧了上述ROS的产生，相关基因的表达和花色素苷含量的增加;而低温下施加NADPH氧化酶的抑制剂DPI、H2O2的清除剂DMTU则通过减少ROS的产生和相关基因的表达而降低了花色素苷的合成。因此，推测低温通过BsRbohD基因产生的ROS诱导了四季秋海棠叶片花色素苷的合成。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 花色素苷简介

1．2 活性氧参与植物细胞调控

1．2．1 活性氧的产生与清除

1．2．2 活性氧与植物的抗逆性

1．2．3 活性氧与花色素苷的合成

1．3 逆境胁迫与花色素苷的合成

1．4 NADPH氧化酶研究进展

1．5 四季秋海棠简介

1．6 本文研究目的与意义

2 引言

3 材料与方法

3．1 试验材料及处理

3．1．2 材料处理

3．2 试验方法

3．2．1 RNA提取、文库构建和测序

3．2．2 质量控制、转录组测序和基因功能注释

3．2．3 基因表达及注释

3．2．4 NADPH氧化酶基因序列的生物信息学分析

3．2．5 RNA的提取与cDNA的合成

3．2．6 实时荧光定量PCR反应与基因表达分析

3．2．7 花色素苷含量测定

3．2．9 超氧自由基(O2·-)含量测定

3．2．10 叶绿素含量的测定

3．2．11 组织化学染色

3．2．10 数据分析

4 结果与分析

4．1 转录组测序结果分析

4．1．1 转录组测序与组装结果分析

4．1．2 转录组测序数据功能注释

4．1．3 差异表达基因分析

4．1．4 KEGG通路富集结果分析

4．1．5 苯丙素生物合成和类黄酮生物合成途径中差异基因的分析

4．2 四季秋海棠BsRbohD基因的生物信息学分析

4．2．1 四季秋海棠BsRbohD的进化分析

4．2．2 四季秋海棠BsRbohD的氨基酸理化性质、结构和功能分析

4．3 低温处理不同时间点BsRbohD基因及花色素苷相关基因表达量的变化

4．3．1 低温处理初始时间BsRbohD基因及花色素苷相关基因的表达量的变化

4．3．2 低温处理持续过程中BsRbohD基因及花色素苷相关基因的表达量的变化

4．4 不同处理下四季秋海棠叶片活性氧含量、花色素苷含量及相关基因表达量的变化

4．4．1 不同处理下叶片活性氧含量、产生速率的变化

4．4．2 不同处理下叶片花色素苷、叶绿素含量的变化

4．4．3 不同处理条件下叶片BsRbohD及花色素苷相关基因的表达量的变化

4．4．4 不同处理下诱导花色素苷合成的机理分析

5 结论与讨论

参考文献