转人抗癌基因P53鸡的研究

摘要

目的：通过构建含有野生型人抗癌基因 P53和报告基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒pEGFP-N1-P53，采用脂质体介导法转染鸡X期胚盘，以期培育出转人类抗癌基因鸡。
　　方法：RT-PCR法从早期肺癌病人的外周血中克隆出人抗癌基因P53，通过酶切、连接、转化构建出扩增质粒 pMD18-T-P53，继而构建出含增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的真核表达质粒 pEGFP-N1-P53。通过脂质体介导的方法转染培养的鸡胚成纤维细胞，荧光显微镜下直接观察该报告基因的表达，以检验重组质粒pEGFP-N1-P53细胞内表达的活性。设计实验，探索最佳的封口方式，保证良好的孵化效果。通过显微注射脂质体介导的真核表达质粒pEGFP-N1-P53法转染鸡X期胚盘，封口后继续孵化，每日照蛋记录鸡胚发育状态，检测死胚及成活鸡外源基因的表达及整合情况。
　　结果：本研究的主要结果如下：
　　（1）从人外周血中克隆出 P53基因功能区片段，结合 pEGFP-N1真核表达载体构建了重组表达质粒 pEGFP-N1-P53，通过 PCR扩增、酶切、测序分析、鸡胚盘成纤维细胞培养方法对重组质粒进行鉴定，结果显示：成功构建了重组表达质粒pEGFP-N1-P53。
　　（2）种蛋开口后采用6种不同封口方法，即蛋壳膜＋封口胶、蛋壳膜＋保鲜膜、蛋壳膜＋石蜡、蛋壳膜+封口膜、蛋壳膜+蛋壳、蛋壳膜+蛋清，并且设立对照组，以研究不同封口方式对孵化率的影响。结果显示：6个试验组鸡胚的孵化率分别为10％、3.3%、3.3%、6.7%、13.3%、16.7%，以蛋壳膜+蛋清效果较佳，对照组的出雏率为86.7%。
　　采用胚盘显微注射结合蛋壳膜+蛋清封口法设计试验，试验组共包含150枚种蛋，孵化结束后得死胚121枚，累计死胚率80.6%；孵化出雏鸡29只，孵化率19.3%，所得实验鸡饲养过程中死亡21只，死亡率72.4%。
　　121枚死胚中，有20枚检测出了绿色荧光蛋白的表达，检出率为16.5%；21只死亡鸡的组织中，有1只检测出了绿色荧光蛋白的表达，检出率为4.7%。PCR法也检测到目的基因的存在，发现其中的8枚鸡胚为人抗癌基因 P53整合阳性，整合率为5.33%（8/150）。
　　结论：成功克隆了野生型人抗癌基因 P53并构建了真核表达载体pEGFP-N1-P53，证实采用外源基因通过脂质体的包埋，胚盘显微注射法可获得转基因鸡，胚盘显微注射法是制备转基因鸡的一条有效途径。

目录

第1章 文献综述

1.1人抗癌基因P53的研究进展

1.2标记基因——增强型绿色荧光蛋白

1.3转基因动物的研究进展

1.4转基因技术的研究及应用

1.5转基因鸡的研究进展

1.6转基因鸡的常用制备方法

1.7本研究的目的和意义

第2章 RT-PCR克隆人抗癌基因P53

2.1试验材料

2.2试验仪器

2.3试验相关试剂

2.4试验方法

2.5试验结果

第3章 pMD18-T-P53扩增载体的构建

3.1试验材料

3.2试验仪器

3.3试验酶类及其他相关试剂

3.4试验方法

3.5试验结果

第4章 pEGFP-N1-P53表达载体的构建

4.1试验材料

4.2试验仪器

4.3试验酶类及其他相关试剂

4.4试验方法

4.5试验结果

4.6讨论

第5章 pEGFP-N1-P53转染鸡胚成纤维细胞

5.1试验材料

5.2试验主要试剂

5.3试验主要仪器

5.4试验方法

5.5试验结果

5.6结果分析

第6章 pEGFP-N1-P53在鸡胚盘内的转染及检测

6.1试验材料

6.2试验主要试剂

6.3试验主要仪器

6.4不同封口方式对孵化率的影响

6.5鸡胚盘内的转染及检测

6.6试验结果

6.7结果分析

第7章 结论

参考文献

附表A 缩略语词汇表

附表B 主要溶液及配制方法

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果