黄曲霉毒素的时间分辨荧光高灵敏免疫检测技术

摘要

黄曲霉毒素B1（AFB1）是由真菌的部分产毒菌株产生的次级代谢产物，广泛存在于各类食品中，在自然界分布也很广泛，它的毒性是最强的。黄曲霉毒素B1是主要对人类和动物的肝脏、肾脏的能够产生强毒和强致癌，AFB1主要污染玉米、大豆、饲料等，进入到人和动物体内，它会引起人和动物的很多病变，甚至死亡。世界卫生组织的癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer,IARC）划定为I类致癌物。要从各个方面严格控制AFB1对人类食品和动物饲料产生污染，将AFB1的危害降到最低，开发新的高灵敏的检测AFB1的方法尤为重要。随着技术的不断发展，时间分辨荧光免疫分析方法(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)得到了快速的发展，它具有没有放射性污染、检测灵敏度高、试验操作简便、重复性好等多种优点，另外TRFIA能够满足大量样品的检测。本研究通过分析AFB1的结构特点，先制备出人工抗原，再通过采集小鼠腹水的方法制备并纯化得到单克隆抗体，成功制备出AFB1间接竞争TRFIA试剂盒并对其性能进行了评价，确立了常见样品的快速处理方法，为AFB1快速检测试剂盒的应用及推广打下了基础。
　　采用N-羟琥珀酰亚胺酯（N-hydroxysuccinimide NHS）法和碳二亚氨法（EDC）将AFB1偶联于载体蛋白BSA上，合成人工抗原AFB1-BSA。并利用紫外扫描法（UV）、SDS-PAGE凝胶电泳试验及单克隆抗体等手段对人工抗原进行了初步鉴定，结果显示：人工抗原的紫外吸收峰包含AFB1及蛋白载体的紫外扫描特征峰，且在此基础上出现了偏移；其分子量较载体蛋白也有所增加；具有良好的免疫原性，从而充分说明了AFB1人工抗原制备成功。
　　采用稀土离子标记技术，应用单克隆抗体建立高灵敏的黄曲霉毒素Bl（AFB1）时间分辨荧光免疫分析法（AFB1-TRFIA）。以AFB1-BSA为免疫原制备抗AFB1抗体；AFB1与BSA的联结物(AFB1-BSA)为固相抗原，与游离AFB1共同竞争有限的AFB1抗体；用Eu3+标记的羊抗鼠抗体作为二抗。该方法的灵敏度为0.0094μg/L，测量范围为0.01-10μg/L，批内和批间的变异率分别为3.05％和4.71%，平均回收率为91.75%，与黄曲霉毒素B2对AFB1的检测有5.12%交叉反应，而赭曲霉毒素A等真菌毒素及BSA则没有交叉反应。试验研究表明，AFB1-TRFIA是目前在AFB1检测中最灵敏和简便的方法之一，该分析方法具有稳定性好、可测范围宽，具有很好的应用前景。

目录

第1章 文献综述

1.1黄曲霉毒素的概述

1.1.1黄曲霉毒素的分类

1.1.2黄曲霉毒素的理化性质

1.1.3黄曲霉毒素的限量标准

1.1.4黄曲霉毒素的毒性

1.1.5黄曲霉毒素的急性和慢性毒性

1.1.6黄曲霉毒素与人类和动物的疾病

1.2黄曲霉毒素的检测方法

1.2.1薄层层析法

1.2.2液相色谱法

1.2.3免疫化学法

1.2.4亲和柱高效液相色谱法

1.2.5时间分辨免疫荧光分析

1.3本课题的立题目的、意义和研究内容

1.3.1立题的目的和意义

1.3.2研究内容

第2章 黄曲霉毒素B1人工抗原和抗体的制备

2.1试验材料

2.1.1主要试剂

2.1.2主要仪器

2.1.3主要溶液

2.1.4试验动物

2.2试验方法

2.2.1人工抗原的合成

2.2.2紫外扫描鉴定

2.2.3 SDS-PAGE凝胶电泳鉴定

2.2.4抗体的制备及鉴定

2.3结果与分析

2.3.1 UV鉴定结果

2.3.2 SDS-PAGE鉴定结果

2.3.3黄曲霉毒素A单克隆抗体的纯化结果

2.3.4单克隆抗体的效价及敏感性测定结果

2.4讨论

2.4.1 AFB1人工抗原的改造

2.4.2 AFB1人工抗原的合成

2.4.3 AFB1人工抗原的鉴定

2.4.4关于单克隆抗体的纯化和效价

2.5本章小节

第3章 黄曲霉毒素B1时间分辨荧光免疫分析方法的建立

3.1试验材料

3.1.1试验仪器多功能酶标仪

3.1.2试验试剂与溶液主要试剂：

3.2试验方法

3.2.1间接竞争AFB1-TRFIA步骤

3.2.2 Eu3+-羊抗鼠的制备

3.2.3 AFB1-TRFIA方法最适反应条件的选择

3.2.4标准曲线的绘制

3.3试验结果

3.3.1 Eu3+-羊抗鼠抗体的免疫学鉴定

3.3.2最佳反应条件的分析

3.3.3标准曲线的绘制

3.4讨论

3.4.1时间分辨荧光法反应模式的选择

3.4.2最适工作浓度的选择

3.4.3灵敏度的影响因素

3.4.4 ELISA与TRFIA两种检测方法的比较

3.5本章小结

第4章 黄曲霉毒素B1间接竞争时间分辨荧光免疫分析方法学考核

4.1试验材料

4.1.1试验仪器多功能酶标仪

4.1.2试验试剂与溶液主要试剂：

4.2试验方法

4.2.1精密度分析

4.2.2灵敏度分析

4.2.3方法的特异性考核

4.2.4方法稳定性考核

4.2.5试剂盒回收率测定

4.3结果与讨论

4.3.1精密度

4.3.2灵敏度

4.3.3特异性

4.3.4稳定性

4.3.5回收率

4.4本章小结

第5章 结论

参考文献

缩略语词汇表

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果