发酵法分离纯化茅岩莓黄酮研究

摘要

以茅岩莓茶叶成品为原料，使用热水为溶剂，浸提茅岩莓黄酮类化合物，发酵法与超滤、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20和重结晶的相结合的分离纯化方法对茅岩莓黄酮粗提物进行分离纯化，运用颜色反应和紫外光谱法初步鉴定，接着采用红外光谱法和高效液相色谱法等鉴定方法对分离纯化得到的黄酮单体化合物进行鉴定。
　　用热水来浸提茅岩莓黄酮化合物，采用单因素实验，考察了四个因素（提取温度，提取时间，液料比，静置时间）对提取率的影响，茅岩莓中二氢杨梅素的最佳水提取工艺通过正交实验确定：液料比20:1，温度90℃下，热水提取90min，并在4℃环境静置1d。二氢杨梅素采用此提取工艺，结果可测得提取率达到12.90％。
　　通过比较空白对照和实验组的黄酮含量，选用4种酵母菌中的葡萄酒酵母SY作为后续的发酵用菌种。利用单因素实验设计，葡萄酒酵母SY培养基优化配方为：1%葡萄糖，2%NH4Cl，0.1%CaCl2，0.1%MgSO4和0.05%KH2PO4。考察发酵时间，发酵温度以及接种量3个因素的影响作用，确定了各因素的二次通用旋转组合设计的因素范围。由二次通用旋转组合实验结果可分析出，发酵过程中，影响还原糖含量的因素主次顺序为：首先发酵时间，其次是发酵温度，最后接种量影响最小。交互作用中，对发酵液中还原糖含量影响显著的是发酵时间与接种量两者。使用响应面分析，由此优化得到最佳发酵条件：培养基中接种5%葡萄糖酵母SY，温度29.5℃下持续发酵23h。采用此条件发酵，发酵液中还原糖含量为0.25mg/mL，比茅岩莓水粗提液中1.10mg/mL还原糖含量下降了约77.3%。将发酵液浓缩，然后烘箱中干燥，得到了纯度为45.6%的茅岩莓粗黄酮。
　　采用超滤、葡萄糖凝胶Sephadex LH-20和重结晶的方法对发酵后得到的黄酮粗提物进行进一步的分离和纯化。单因素实验优化出，在0.2MPa的工作压强和40℃的超滤温度下进行超滤。采用最优条件进行超滤，超滤后黄酮纯度提高了约25%。进一步的分离纯化是利用葡萄糖凝胶Sephadex LH-20来进行。紫外分光光度法初步检测，结合高效液相色谱的后续检测，分离出了黄酮单体化合物。收集与标准品图谱相近的洗脱液，浓缩干燥，得到黄酮单体88.5mg。经高效液相色谱检测，表明纯度为98.23%。重结晶法采用了两种工艺对超滤后得到的粗黄酮粉进行纯化。丙酮回流结合水重结晶法所得二氢杨梅素纯度明显高于工艺一，回收率也更高。
　　最后通过颜色反应，可以初步判断该单体化合物是二氢黄酮类化合物，紫外分光光谱红外光谱判断出该二氢黄酮类化合物结构，该二氢黄酮类化合物最后通过高效液相色谱确定为二氢杨梅素。
　　本实验创新地采用了发酵法分离纯化茅岩莓黄酮，与超滤和葡聚糖凝胶等方法相合。以期能改善现在传统技术的缺点，创造更多的新兴技术，为茅岩莓资源和黄酮的开发利用提供理论基础。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 茅岩莓简介

1.2 黄酮类化合物研究现状

1.3 微生物发酵法在黄酮类化合物分离纯化中的应用

1.4 研究的目的及意义

第2章 茅岩莓中二氢杨梅素的提取

2.1 材料与仪器

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

第3章 酵母菌发酵法提纯茅岩莓黄酮工艺研究

3.1 材料与仪器

3.2 实验方法

3.3 最佳发酵菌株的筛选

3.4 单因素实验

3.5 结果与分析

3.6 本章小结

第4章超滤和Sephadex LH-20分离纯化茅岩莓黄酮研究

4.1 材料和仪器

4.2 实验方法

4.3 实验结果与分析

4.4 本章小结

第5章 茅岩莓黄酮的鉴定与结构分析

5.1 材料与仪器

5.2 实验方法

5.3 实验结果与分析

5.4 本章小结

第6章 结论与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果