短链脂肪酸作用下伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡的研究

摘要

伤寒沙门菌属胞内寄生菌，可引起伤寒等严重疾病，它在巨噬细胞内存活、增殖的能力与其致病性密切相关。巨噬细胞是人体主要的吞噬细胞，它在许多病原体的清除和破坏中起重要作用。近来研究发现伤寒沙门菌感染后可导致巨噬细胞异常凋亡，从而逃避机体天然免疫系统的识别。但伤寒沙门菌引起细胞凋亡的确切机制及生存环境对伤寒沙门菌诱导细胞凋亡的影响还有待于进一步研究。其中就包括伤寒沙门菌在人体肠道内所遭遇的短链脂肪酸（short chain fatty acid SCFA）环境。本课题拟用醋酸钠刺激伤寒沙门菌的生长以模拟体内的SCFA条件，以人白血病细胞系 THP-1细胞经佛波醇酯(PMA)分化的巨噬细胞为模型，探讨短链脂肪酸作用下伤寒沙门菌对巨噬细胞凋亡的影响，从而深入研究伤寒沙门菌的致病机制。同时，分析短链脂肪酸作用下伤寒沙门菌外膜蛋白的表达，与普通培养条件下伤寒沙门菌外膜蛋白进行比较，观察其差别。
　　实验分三组：普通伤寒沙门菌组；SCFA作用伤寒沙门菌组；同时设立空白对照组，各组细菌按20：1与PMA分化的THP-1细胞建立感染模型，流式细胞仪检测细胞凋亡。分别加入caspase3，caspase8，caspase9抑制剂及TNF-α抗体，观察其对细菌感染后细胞凋亡的影响。比色法检测caspase3，caspase8，caspase9含量，硝酸还原酶法和 ELISA法分别检测培养液中一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度变化。用普通LB液体培养基及含6％100 mmol/l醋酸钠的LB培养基培养伤寒沙门菌，超声破碎法提取伤寒沙门菌外膜蛋白， SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色，在复日FR-200紫外与可见分析装置下成像及分析。
　　结果发现：空白对照组巨噬细胞于2，4，8，12，24h的凋亡率分别为（0.76±0.15）％；（1.69±0.25）％；（3.29±0.53）％；（5.22±0.49）％；（7.66±0.64）％，伤寒沙门菌原菌组感染巨噬细胞后2，4，8，12，24h的细胞凋亡率分别为（4.07±0.80）％；（7.14±0.89）％；（12.15±1.44）％；（22.17±2.90）％；（40.54±2.54）％， SCFA作用伤寒沙门菌组感染巨噬细胞后相应时段细胞凋亡率分别为（7.99±0.84）％；（12.70±1.13）％；（20.87±1.79）％；（33.94±2.33）％；（63.84±5.97）％。结果显示两组细菌感染组细胞凋亡率均高于对照组，且凋亡率随时间延长而增长（P<0.01）,SCFA作用组细胞凋亡率各时段均高于伤寒沙门菌原菌组（P<0.01）。说明伤寒沙门菌可以诱导巨噬细胞凋亡，SCFA作用下，伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡能力增强。
　　caspase3/8/9抑制剂作用细胞后加入细菌感染8 h，Annexin V-FITC染色流式细胞仪检测巨噬细胞凋亡率，结果发现caspase3，caspase8抑制剂均能不同程度的减少细胞凋亡的发生（P<0.01），caspase9抑制剂对细胞凋亡结果无明显影响。用anti-TNF-α阻断TNF-α后加入两组伤寒沙门菌感染8 h， Annexin V-FITC染色流式细胞仪检测巨噬细胞凋亡率，发现伤寒沙门菌组及SCFA作用伤寒沙门菌组凋亡率均明显降低（P<0.01），说明 caspase3，caspase8，TNF-α在两组伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡机制中均起一定作用，而caspase9在其中无明显作用。
　　伤寒沙门菌原菌及 SCFA作用菌感染巨噬细胞8h，比色法检测 caspase3， caspase8，caspase9含量，两组细菌感染组 caspase3，caspase8含量均高于对照组（P<0.01），caspase9含量与对照组比较无明显差别。SCFA作用组caspase3，caspase8两者含量均高于伤寒沙门菌原菌组（P<0.01），进一步证实了 caspase3，caspase8在伤寒沙门菌原菌及SCFA作用菌诱导巨噬细胞凋亡中均起一定作用，而caspase9在其中无明显作用。
　　伤寒沙门菌原菌及 SCFA作用菌感染巨噬细胞8h， ELISA法检测培养液中TNF-α浓度,结果显示伤寒沙门菌原菌组与SCFA作用组TNF-α浓度均较对照组明显升高（P<0.01），而且SCFA作用组TNF-α高于原菌组。证实TNF-α在伤寒沙门菌原菌及SCFA作用菌诱导巨噬细胞凋亡中均起一定作用。
　　伤寒沙门菌原菌及SCFA作用菌感染巨噬细胞8h，硝酸还原酶法检测NO含量，结果显示伤寒沙门菌 SCFA作用组与原菌组 NO浓度均较对照组明显升高（P<0.01），且SCFA作用组NO浓度高于原菌组。
　　超声破碎法提取伤寒沙门菌原菌及SCFA作用菌外膜蛋白，SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝 R250染色，在复日 FR-200紫外与可见分析装置下成像及分析可见55KD处SCFA作用菌外膜蛋白表达高于伤寒沙门菌原菌，这点与文献一致。
　　本课题主要对短链脂肪酸作用下伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡过程及其机制进行了探讨，并观察短链脂肪酸作用下伤寒沙门菌外膜蛋白表达的变化。通过以上实验证明：短链脂肪酸作用下伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡能力增强；伤寒沙门菌及其 SCFA作用菌诱导巨噬细胞凋亡主要通过 TNF-α介导的caspase3， caspase8参与的外源性死亡因子受体途迳；在凋亡过程中，NO产生增加；短链脂肪酸作用下伤寒沙门菌55KD外膜蛋白表达增加。这对于我们更好的了解伤寒沙门菌在人体内的致病性及为临床防治伤寒沙门菌感染提供了参考。

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中文摘要

英文摘要

前言

材 料 和 方 法

1. 实验材料

2．实验方法

3. 统计学处理

结果

1. AnnexinV-FITC染色流式细胞仪检测结果

2 比色法检测细胞中caspase3，caspase8，caspase9含量

3 检测细胞培养液中TNF-α，NO含量

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A英文缩略词表

附录B常用试剂配制

附录C个人简历

附录D 综述: Caspase-8、caspase3及线粒体膜电位与细胞凋亡的研究