基于便携式血糖仪检测肉中盐酸克伦特罗方法的研究

摘要

盐酸克伦特罗（Clenbuterol Hydrochloride，CLB），又称瘦肉精，化学结构稳定，加热温度至172℃方可分解，极易在动物组织中残留。盐酸克伦特罗对人体危害极大，消费者食用含有瘦肉精的动物肉，会引起急性中毒和慢性中毒。盐酸克伦特罗是我国在动物饲养过程中禁止使用的一种药物，许多国家、国际组织均制定有严格的规定。
　　目前常用的检测CLB的方法主要有酶联免疫法、胶体金快速检测试纸条、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和生物传感技术等，但这些方法分别适用不同的检测对象，各有利弊。因此，开发一种灵敏、便捷的方法检测肉中CLB的残留十分必要。
　　本试验构建了一种基于便携式血糖仪检测CLB残留的方法。试验利用磁性分离技术，建立一种新型磁性免疫生物传感探针检测技术，利用便携式血糖仪检测免疫反应引入的转化酶催化底物产生的信号，准确地定量CLB残留。该方法操作简单、灵敏度高、检测成本低。
　　研究结果如下：
　　（1）以单分散羧基磁珠为载体，盐酸克伦特罗完全抗原（CLB-BSA）为标记物制备磁性免疫传感探针。通过单因素试验研究了CLB-BSA添加量、反应温度、反应时间对偶联率的影响；通过Box–Behnken实验设计，建立了偶联率随CLB-BSA添加量、反应温度、反应时间变化的回归模型：Y=－151.943+7.700X2+6.095X3-0.0175X1X2+0.0125X1X3-0.01745X12-0.13625X22-0.2325X32。回归模型高度显著，失拟项不显著，决定系数高(R2=0.9909)，可用于实际预测。自变量对偶联率影响大小的次序为反应温度﹥反应时间﹥CLB-BSA添加量。
　　通过响应面法对磁性免疫传感探针制备中CLB-BSA添加量、反应温度、反应时间进行优化，得到制备条件的最佳参数为 CLB-BSA添加量41μg、反应温度25℃、反应时间13 h。在最优条件下进行了5次验证，实际测得的平均偶联率为15.22％，与理论值仅相差0.25%。
　　（2）制备胶体金/二抗/转化酶复合物（IgG-AuNPs-Invertase）的最佳胶体金溶液pH为8.5、转化酶浓度为120μg/mL，兔抗羊IgG浓度为12μg/mL，转化酶与兔抗羊IgG浓度比为10:1。
　　紫外-可见吸收光谱图显示，制备的胶体金溶液具有较好均一性，采用本试验的标记方法，可成功使二抗、转化酶标记于胶体金表面；透射电镜照片显示，制备的IgG-AuNPs-Invertase颗粒均匀分散，颗粒周围有一圈模糊可见的晕圈，同时粒径变大，说明IgG和Invertase被成功标记到胶体金颗粒表面。
　　（3）本试验优化了基于便携式血糖仪检测CLB残留的测定条件，结果表明：免疫磁珠探针的用量25μg、CLB抗体1:800稀释、IgG-AuNPs-Invertase稀释度1:500；转化酶参与水解反应的最适温度为55℃、时间为30 min。
　　（4）本试验构建了一种基于便携式血糖仪检测CLB残留的方法。试验表明，该方法灵敏度高，其检测限为0.1 ng/mL，CLB浓度在0.1～100 ng/mL的范围内，具有良好的线性关系，回归方程决定系数（R2）为0.9969；在1 ng/g（低）、5 ng/g（中）、15 ng/g（高）添加水平下其回收率在85%～94%，标准差在5%以内，说明本方法有较高的准确度；批内变异系数在1.2%～1.6%、批间变异系数在1.1%～8.8%，说明再现性和稳定性较好；对沙丁胺醇和莱克多巴胺有极低的交叉反应性，说明特异性好。
　　（5）向6份未检出CLB的肉样添加CLB，使肉样中CLB的最终浓度为0.2 ng/g、5 ng/g、10 ng/g、15 ng/g、20 ng/g、50 ng/g，并与采集的25份待测肉样进行随机编号，对两种方法同时检出的结果进行显著性分析和线性回归分析，经分析差异不显著；线性方程：Y=0.8787X+0.0668，R2=0.9981，与HPLC法检测结合符合度较高。因此说明本试验构建的方法准确、可靠。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 盐酸克伦特罗概述

1.2 磁性微粒在食品分析检测中的应用

1.3 便携式血糖仪的发展和应用现状

1.4 研究意义和内容

第2章 免疫磁珠探针的制备

2.1 材料与仪器

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

第3章 IgG-AuNPs-Invertase复合物的制备及表征

3.1 试验材料与仪器

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

第4章 基于便携式血糖仪检测CLB方法的构建

4.1 试验材料与仪器

4.2 试验原理

4.3 试验方法

4.4 结果与分析

4.5 讨论

4.6 本章小结

第5章 结论

参考文献

缩略语词汇表

致谢

攻读学位期间的研究成果