神经鞘磷脂合成酶基因沉默对SMMC-7721细胞凋亡的影响(血清SM、CETP和PLTP对2型糖尿病形成的作用)

摘要

近年报道称ⅡTDM(Ⅱ Type Diabetes mellitus，Ⅱ TDM)与动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)关系密切，炎症可能是二者之间共同的病理基础。已知神经鞘磷脂(sphingomyelin，SM)是AS的独立危险因子，推测神经鞘磷脂对ⅡTDM有一定的影响。又知神经酰胺(Ceramide，Cer)是调节细胞凋亡、增殖的重要信号分子，SM和Cer均是鞘脂代谢的重要化合物，神经鞘磷脂合成酶(sphingomyelin synthase，SMS)是催化底物卵磷脂(Phosphatidylcholine，PC)和Cer生成产物SM和甘油二酯(Diglyceride，DAG)的关键酶，且动脉粥样硬化和ⅡTDM患者均存在脂代谢紊乱。因此，本课题以SMMC-7721细胞为实验模型，研究神经鞘磷脂合成酶基因沉默后与细胞凋亡的关系，并检测ⅡTDM患者血清中SM、磷脂转移蛋白(phospholipid transfer protein，PLTP)及胆固醇酯转移蛋白(cholesterol ester transfer protein，CETP)水平，探讨与ⅡTDM的关系。
　　 目的：
　　 观察神经鞘磷脂合成酶基因沉默后其酶活性水平及细胞凋亡作用，探讨血清SM、CETP和PIXP水平与ⅡTDM之间的关系，为ⅡTDM发生机制和临床治疗提供理论依据。
　　 方法：
　　 以人肝癌(SMMC-7721)细胞作为实验模型，用MTT法筛选肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导SMMC-7721细胞凋亡的剂量、采用RNA干扰技术使神经鞘磷脂合成酶基因沉默、用薄层层法检测神经鞘磷脂合成酶基因沉默后酶活性水平、Annexin V-FITC/PI双染法和Hoechst33258/PI检测细胞凋亡情况、Western blot检测Caspase-8及Caspase-3蛋白表达的变化。根据2009年美国糖尿病协会确诊ⅡTDM，酶法检测ⅡTDM患者血清SM水平与血糖值和荧光分析法测定CETP及PLTP水平。
　　 结果：
　　 MTT显示不同浓度的TNF-α作用对SMMC-7721细胞均有凋亡作用，凋亡率与其浓度呈正相关(剂量依赖关系)，经筛选后本实验以TNF-α的浓度为200ng·μL-1诱导凋亡、基因沉默后神经鞘磷脂合成酶活性水平降低、细胞凋亡率升高，与对照组相比有显著差异、Caspase-8及Caspase-3蛋白量表达增加。ⅡTDM患者血清SM、PLTP和CETP水平高于对照组(P<0.05)。
　　 结论：
　　 1.神经鞘磷脂合成酶基因沉默后其酶活性水平下降、凋亡率升高；
　　 2.血清高水平神经鞘磷脂、磷脂转移蛋白和胆固醇脂转移蛋白对ⅡTDM的发生具有促进作用。