高温和定点突变方法对蛋白质的结构稳定性研究

摘要

蛋白质是生物体内重要的组成成分之一，几乎参与所有的生命过程和细胞活动。它在细胞的信号转导、生物代谢、细胞粘附、个体生长发育、蛋白质-蛋白质相互作用等方面都扮演着重要的角色。大多数蛋白质在生物细胞体内都处于解聚和聚合的动态过程，并且其动态过程会受到细胞内环境的影响，而这种动态特征又是实现其生理功能的前提条件。因此，研究蛋白质的结构变化及稳定性对了解生理功能的发挥具有重要意义。本论文主要采用分子动力学(Molecular Dynamics，MD)模拟与操控式分子动力学(Steered Molecular Dynamics，SMD)模拟相结合的方法，选取了可传播性海绵状脑病(Transmissible Spongiform Encephalopathies，TSE)相关的朊蛋白体系和糖尿病相关的胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factors，IGFs)与胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF-binding proteins，IGFBPs)体系，从原子尺度探讨了蛋白质分子内及分子间相互作用与结构稳定性的关系，研究了升温和定点突变方法对蛋白质高级结构稳定性的影响。这有助于更深入的理解蛋白质相互作用的分子基础，为相关的药物分子设计和关键位点的检测方法提供可行性建议。
　　论文主要由以下五部分组成:
　　第1章，对蛋白质及其蛋白质-蛋白质相互作用进行简要的介绍，并概述了研究蛋白质结构稳定性常用的方法和主要内容。
　　第2章，介绍了分子动力学模拟和操控式分子动力学模拟方法的基本原理。
　　第3章，使用MD模拟，结合单点丙氨酸突变方法研究了IGF-Ⅰ与IGFBPs之间的相互作用以及突变效应对二者之间相互作用位点和结合能力的影响。研究发现，IGF-Ⅰ与IGFBPs静态的结合位点在动态结构中会发生变化，动力学方法有助于清楚地理解二者的结合机理。以占有率为准则筛选出六个突变位点，用丙氨酸突变扫描比较分析了突变对二者结合能力的影响。从原子尺度上解释了IGF-Ⅰ与IGFBPs之间的相互作用机理，详细分析了突变效应对构象和结构的影响，从新的角度更加详尽的阐释了定点突变体系所表现出来的生物化学性能并不能直接用于表征被突变残基的生物学功能这一观点。
　　第4章，分别采用单点突变和多点突变方法研究了IGFBP4与IGF-Ⅰ之间的相互作用情况以及关键结合位点的分布特征，并对反极性定点突变方法对二者之间相互作用的影响进行了分析。研究发现，定点突变不一定会直接引起解螺旋的发生，并且二级结构的变化并不是影响二者之间结合能力的根本原因。因此，采用定点突变的方法来研究单个残基在整个体系中的生物学活性是不合适的。多点突变的结果也说明，突变效应并不一定随着突变位点的增加而增加，突变位点的选择才是有效定点突变的关键所在。
　　第5章，研究了温度诱导动物朊蛋白的解折叠机理，探讨了不同温度对动物朊蛋白的解折叠路径的影响，并比较分析了三级结构略有不同的两个动物朊蛋白的解折叠信息。研究发现，不同温度下二级结构解折叠顺序相似，与文献中的研究结论一致。β-折叠在两个动物朊蛋白体系中都是非常活跃的二级结构单元，在所有的温度条件下都出现了延长、缩短和解折叠的现象。相对于β-折叠的活跃，α-螺旋在高温条件下表现出相对的稳定性。高温下螺旋的解折叠是从柔性较大的端基开始，由外而内螺旋逐步被解开，在解螺旋过程中，π-螺旋是出现较多的中间构象。并且通过比较不同温度下螺旋的百分比随时间变化曲线，发现螺旋的含量随着温度的升高而逐渐降低，体现出了α-螺旋解折叠对温度具有有序的响应特征。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 蛋白质结构与功能的关系

1．3 蛋白质-蛋白质的相互作用

1．4 研究蛋白质体系的常用方法

1．4．1 实验测定方法

1．4．2 分子动力学模拟

1．4．3 定点突变方法

1．4．4 加速蛋白质解折叠的理论方法

1．5 本文的研究工作

1．5．1 单点丙氨酸突变方法研究突变效应对IGF-I与IGFBPs之间的相互作用的影响

1．5．2 单点和多点突变扫描研究IGFBP4与IGF-I之间相互作用机理

1．5．3 温度诱导动物朊蛋白解折叠的分子动力学研究

参考文献

2 分子动力学模拟计算方法

2．1 引言

2．2 分子动力学基础

2．2．1 基本原理

2．2．2 运动方程求解

2．2．3 周期性边界条件

2．2．4 各种系综的分子动力计算方法

2．2．5 分子动力学模拟的基本流程

2．3 SMD模拟方法

2．3．1 SMD模拟简介

2．3．2 SMD模拟原理

参考文献

3 单点丙氨酸突变方法研究突变效应对IGF-I与IGFBPs之间的相互作用影响

3．1 引言

3．2 模型和方法

3．2．1 体系的构建

3．2．2 MD模拟

3．2．3 SMD模拟

3．2．4 分析方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 平衡态的获取

3．3．2 相互作用能分析

3．3．3 动态和静态结构的比较

3．3．4 突变位点的选择

3．3．5 突变体系的平衡模拟

3．3．6 突变体系的结合位点分析

3．3．7 定点突变对构象和构型的影响

3．3．8 IGF-I突变体系的描述

3．3．9 相互作用网络

3．4 结论

参考文献

4 单点和多点突变扫描研究IGFBP4与IGF-I之间相互作用机理

4．1 引言

4．2 模型和方法

4．2．1 体系的构建

4．2．2 突变体系的准备

4．2．3 MD模拟

4．2．4 SMD模拟

4．3 结果与讨论

4．3．1 未突变体系平衡态

4．3．2 SMD模拟及突变位点的筛选

4．3．3 单点突变体系的脱附动力学

4．3．4 多点连续突变体系的脱附动力学

4．3．5 突变效应图

4．4 结论

参考文献

5 温度诱导动物朊蛋白解折叠的分子动力学研究

5．1 引言

5．2 模型和方法

5．2．1 体系的构建

5．2．2 模拟准备

5．2．3 初始温度

5．3 结果与讨论

5．3．1 不同温度下结构的稳定性

5．3．2 不同温度下结构的柔性

5．3．3 二级结构的演变

5．3．4 表面积

5．3．5 残基-残基接触

5．3．6 523 K时蛋白质解折叠的对比

5．4 结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢