基于CRISPR/Cas9系统的基因打靶研究

摘要

基因打靶技术是外源DNA与受体细胞染色体DNA之间发生同源重组，从而定点改变基因组遗传信息的一项技术。基因打靶技术的出现是分子生物学领域的重大突破。目前为止，基因打靶技术已成功应用于基因结构和功能的研究、基因的表达与调控研究、动植物转基因的研究和基因治疗等诸多方面。本研究是利用CRISPR/Cas9系统进行基因打靶。CRISPR/Cas9系统是目前最先进、最高效的介导基因组编辑的方法，它与ZFN系统和TALEN系统相比更具优异性，具体体现在：CRISPR/Cas9系统载体构建更为简便且成本低廉；CRISPR/Cas9系统能实现多个位点、多个基因的同时打靶。基因打靶，最为重要的是打靶效率，高的打靶效率才更易实现遗传物质的改造，更具研究价值。
　　本研究主要内容包括：⑴基于CRISPR/Cas9系统对293T细胞进行基因打靶，获得了63％的高效打靶效率。⑵通过对CRISPR/Cas9系统中gRNA结构及功能的研究，选用三段合成法构建了4个gRNA（Meg3-3’-gRNA，Meg3-5’-gRNA，Kcnq1ot1-3’-gRNA，Kcnq1ot1-5’-gRNA）打靶载体。⑶建立一种新的打靶效率的检测方法：在两个荧光标记（樱桃红色荧光和绿色荧光）之间的绿色荧光启动子区靶位点添加终止密码子，促使中靶细胞由于移码突变均能表达两种荧光，而未中靶细胞只能表达红色荧光，最后协同流式细胞术的荧光定量分析获得细胞的打靶效率。⑷经流式细胞仪分析，所选取的三个gRNA检测位点均有较高的打靶效率，打靶效率分别为50.3%，73.5%，84.5%，更进一步说明利用CRISPR/Cas9系统进行基因打靶的高效性。⑸构建小鼠ES细胞的同源替换打靶载体（Meg3和Kcnq1ot1）以及相应靶点的4个gRNA载体，实现了小鼠Meg3基因及Kcnq1ot1基因的定点敲除。⑹通过荧光筛选及药物筛选并结合PCR技术，成功筛选鉴定出敲除Meg3、Kcnq1ot1单基因的小鼠ES细胞，并获得Meg3-14.3%，Kcnq1ot1-11.5%的打靶效率。

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1引言

1.1 基因打靶技术

1.2 锌指核酸酶(ZFN)

1.3 转录激活因子类似效应因子核酸酶（TALEN）

1.4 常间回文重复序列丛集关联蛋白系统（CRISPR/Cas）

1.5 检测基因打靶效率的方法

1.6 Kcnq1ot1及Meg3基因简介

1.7 293T细胞与小鼠ES细胞简介

1.8 脂质体转染与电转染简介

1.9 研究的主要内容及意义

2 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.2 试验方法

3 结果与分析

3.1打靶载体的构建结果

3.2 细胞实验结果

3.3 细胞鉴定结果

4 讨论

4.1 gRNA的构建方法

4.2 双链断裂工具CRISPR/Cas9系统

4.3 CRISPR/Cas9打靶效率检测方法

5 结论

参考文献

致谢