基质金属蛋白酶和促血管生成素在垂体腺瘤中的表达及意义

摘要

目的：垂体腺瘤是一种颅内较常见的良性肿瘤，约占颅内肿瘤的10％-20％。一般呈局限性生长，不发生远处转移。但部分垂体腺瘤的生长成侵袭性，可侵袭周围的脑组织，血管，海绵窦，破坏鞍区骨质等，表现为恶性肿瘤的特性，向周围侵润性生长，手术全切除十分困难，因此术后还需要进行放射治疗等辅助治疗手段；对于临床医生来说，对侵袭性的垂体腺瘤进行根治是很困难的，有较高的术后复发率。总体愈后仍较差。是目前神经外科治疗上的一个难题。 大量研究结果证实：实体肿瘤的生长和代谢需要持续的血管生长。新生血管的生成、长入，为其提供营养物质与肿瘤的生长、侵润、转移的整个过程密不可分。肿瘤细胞与间质血管之间是相互依赖的：瘤细胞产生、分泌一系列血管生成因子和抑制因子调控肿瘤的血管生成，肿瘤间质血管生成反过来又促进肿瘤生长。促血管生成素(Ang-iopoietin，Ang)家族的重要成员Ang-1，Ang-2对于血管生成、成熟、重塑和维持的作用近年来才得以发现。此外，肿瘤对周围结构和组织的侵犯是一种复杂的生物学行为。肿瘤发生侵袭，一般要具备降解细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)和基底膜的能力。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)家族的重要成员MMP-9是一种蛋白水解酶，其底物主要是Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原，明胶及弹性纤维。MMP-9能够破坏基底膜和细胞外基质，从而促进肿瘤的侵袭与转移。最近发现MMP-9，Ang-1和Ang-2在颅内肿瘤的发生及侵润过程中起着重要作用，但具体机理尚未完全阐明。 本试验通过检测侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤中，MMP-9和Ang-1，Ang-2各自的蛋白和mRNA的表达水平，从而初步研究和探讨它们与垂体腺瘤及其侵袭性的关系，为侵袭性垂体腺瘤的发生机理提供分子水平的理论依据，并为临床治疗提供一条可能的新途径。 方法：垂体腺瘤组织标本来自于2003年10月至2005年9月间，河北医科大学附属第二医院神经外科手术切除的40例垂体腺瘤。40例标本中，有24例女性，16例男性。平均年龄为49.9岁(从17～67岁)。其中，11例为侵袭性垂体腺瘤，29例为非侵袭性垂体腺瘤。 用免疫组织化学链霉素亲生物素-过氧化酶连接法(StreptavidinPeroxidaseConjugatedMethodSP法)对40例垂体腺瘤组织标本表达的MMP-9，Ang-1和Ang-2蛋白进行检测：标本固定、包埋蜡块、切片；脱蜡和水化；抗原修复；滴加正常山羊血清；滴加Ⅰ抗50μl；滴加Ⅱ抗50μl；脱水、透明、封片、镜检。 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法对其中11例垂体腺瘤组织标本中MMP-9，Ang-1及Ang-2mRNA的表达进行分析：垂体瘤细胞总RNA的提取：采用Trizol法提取细胞总RNA；cDNA合成：逆转录反应体系15μl，包括细胞总RNA4μl，随机引物1μl，Rnasin0.5μl，5×M-MLV逆转录反应缓冲液3μl，dNTP1.5μl，MgCl20.5μl，M-MLV逆转录酶1μl，DEPC水3.5μl。37℃30分钟，95℃5分钟灭活M-MLV逆转录酶；引物合成：引物序列检索自NCBINucleotide数据库，采用，Primer5.0软件设计，由北京赛百盛公司合成；PCR反应：反应体系25μl，扩增条件：均先采用94℃预变性5分钟，72℃时加入Taq酶。Ang-1：94℃变性30秒，49℃退火30秒，72℃延伸30秒，40个循环。Ang-2：94℃变性30秒，48℃退火35秒，72℃延伸35秒，40个循环。MMP-9：94℃变性30秒，56℃退火35秒，72℃延伸35秒，40个循环。β-actin：94℃变性30秒，53℃退火35秒，72℃延伸35秒，40个循环。产物分析：取25μl扩增产物，在1.8％琼脂糖凝胶上进行电泳100V，(50分钟)，goodview染色，紫外透射仪上观察结果同时应用读胶仪读取各条产物带的光密度值并照相。 结果统计分析：测得数据用均数±标准差(x±s)表示。应用统计分析软件SPSS11.0进行统计分析，免疫组化统计方法采用两独立样本比较Wilcoxon检验，Spearman秩相关分析。RT-PCR统计方法采用两独立样本t检验及Pearson相关分析。 结果：免疫组织化学结果显示：MMP-9的表达主要定位在肿瘤细胞细胞浆，Ang-1，Ang-2的表达主要定位在肿瘤细胞和血管内皮细胞细胞浆，阳性皆呈棕黄色颗粒。MMP-9蛋白及Ang-2蛋白在侵袭性垂体腺瘤组中的表达明显高于非侵袭性垂体腺瘤组(1.513±0.280；0.883±0.245p＜0.01)和(1.455±0.280；0.935±0.291p＜0.025)。Ang-1蛋白在侵袭性垂体腺瘤组中的表达明显低于非侵袭性垂体腺瘤组(0.889±0.323；1.263±0.38p＜0.01)。MMP-9和Ang-1，MMP-9和Ang-2,之间无明显相关性(rs值分别为-0.350，0.550；p＞0.05)。Ang-1和Ang-2呈负相关(rs值为-0.800p＜0.05)。 RT-PCR结果显示：MMP-9mRNA及Ang-2mRNA在侵袭性垂体腺瘤组中的表达明显高于非侵袭性垂体腺瘤组(1.513±0.280；0.883±0.245p＜0.005)及(1.455±0.280；0.935±0.291p＜0.005)。Ang-1mRNA在侵袭性垂体腺瘤组中的表达明显低于非侵袭性垂体腺瘤组(0.889±0.323；1.263±0.38p＜0.005)，差异有显著性。MMP-9和Ang-1，MMP-9和Ang-2之间无明显相关性(r值分别为0.2966；0.3758p＞0.05)。Ang-1和Ang-2之间有负相关性(r值为-0.6751；p＜0.05。 结论：MMP-9在侵袭性垂体腺瘤中的表达明显高于非侵袭性垂体腺瘤，表明MMP-9的高表达与垂体腺瘤的侵袭性密切相关；结合相关文献资料可知，MMP-9活性上调可改建细胞外基质，促进细胞外基质降解，破坏细胞基底膜。因此，MMP-9在侵袭性垂体腺瘤中的高表达可能是促进垂体腺瘤向周围组织侵袭的一个重要原因。 Ang-2在侵袭性垂体腺瘤中表达的明显高于非侵袭性垂体腺瘤，表明Ang-2的高表达与垂体腺瘤的侵袭性密切相关；结合相关文献资料可知，Ang-2通过与Tie-2受体结合，拮抗Ang-1的作用，使血管内皮细胞同周围的支持细胞发生解离，降低血管的稳定性，使其更易受其它促血管生成因子的刺激，在两者的共同作用下，引起肿瘤的血管生成。因此，Ang-2在侵袭性垂体腺瘤中的高表达可能是促进肿瘤血管的生成和侵袭的一个重要原因。 Ang-1在非侵袭性垂体腺瘤中表达的明显高于侵袭性垂体腺瘤；结合相关文献资料可知，Ang-1通和Tie-2受体结合，促进受体磷酸化，通过下游途径调节血管成熟过程，并通过细胞-细胞，细胞-基质等相互作用维持血管结构稳定，因此，Ang-1在非侵袭性垂体腺瘤中的高表达可能是维持肿瘤血管结构稳定的一个重要原因。并由此可能抑制垂体腺瘤的血管生成和侵袭。 Ang-1与Ang-2在侵袭性垂体腺瘤中的表达呈负相关，表明Ang-2表达上调和Ang-1表达下调可能促进肿瘤血管生成，并可能与垂体腺瘤的侵袭性有关；MMP-9与Ang-1，Ang-2在垂体腺瘤中的表达未见明显相关性，表明垂体腺瘤的侵袭性和血管生成之间可能存在不同的生物学机制。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 垂体腺瘤发生机制的基因研究进展

致谢

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