老年人MBL基因ExonⅠ点突变频率及其血浆含量变化研究

摘要

目的：甘露(聚)糖结合凝集素(mannose-bindinglectin，MBL)是一种主要由肝脏合成的急性时相蛋白，属于凝集素家族，在天然免疫中发挥重要作用。研究发现，MBL水平与多种疾病有关，MBL缺失或含量低下可增加感染性疾病的易感性和感染的严重程度。目前发现MBL基因ExonⅠ52、54和57位密码子碱基突变是血中MBL缺乏或低下的主要原因。老年人免疫功能会有不同程度的减退，衰老对MBL的影响，国内研究较少。本研究的主要目的是调查健康老年人MBL基因ExonⅠ52、54和57化密码子点突变的频率和血浆MBL含量变化，为进一步探讨老年人天然免疫功能状态，从抗感染免疫的角度为MBL在老年人的感染预防和治疗中的应用奠定基础。 方法： 1标本的收集与处理：收集汉族79例健康老年人、64例中青年人(作为对照)健康体检全血标本(EDTA-Na2)，分离血浆与细胞成分，血浆用于MBL含量测定，细胞成分用于提取DNA；取细胞成分，低渗溶血法溶解红细胞，提取白细胞，用盐酸胍法捉取DNA，采用紫外吸收法进行DNA纯度及含量的测定。 2MBL基因ExonⅠ52、54和57位密码子点突变检测方法的建立：(1)52位密码子点突变检测方法即PCR-SSP的建立：①参照文献由大连宝生物工程有限公司合成两对序列特异性引物：52位密码子突变型引物(primerl和primer2)和野生型引物(primerl和primer3)。引物序列为：primerl(上游)：5’-CACCCAGATTGTAGGACAGAG-3’；primer2(下游)：5’-TCTCCCTTGGTGCCATCAC(A)-3’；primer3(下游)5’-TCTCCCTTGGTGCCATCACG-3’。②优化选择PCR反应的最佳条件：将Mg2+、dNTPs和TaqDNA聚合酶浓度设置为不同的浓度梯度进行优化试验。③特异性试验：采用从HBV和结核杆菌提取的DNA作为对照，进行扩增，鉴定是否出现预期大小的DNA片断，选择不同类型的标本测序，进一步验证方法的可靠性。④重复性试验：同一标本在相同条件下，5天内连续测定5次。(2)MBL基因54、57位密码子点突变检测方法即PCR-RFLP的建立：①引物的设计与合成：根据MBL基因ExonⅠ的序列设计一对引物，引物序列为primer1(上游)：5-AGGGCATGCTCGGTAAAT-3；primer2(下游)：5-CTCATATCCCCAGGCAGTT-3。②优化选择PCR反应的最佳条件：Mg2+、dNTPs和TaqDNA聚合酶浓度优化试验同PCR-SSP的建立；退火温度设置为53℃、55℃、58℃和60℃四个温度进行优化选择。③特异性和重复性试验同PCR-SSP建立。④BanⅠ和MboⅡ酶切扩增产物：PCR产物纯化，纯化的PCR产物用BanⅠ和MboⅡ酶切，分别用于54、57位密码子点突变检测。⑤根据酶切结果，选择不同类型的标本测序，进一步验证方法的可靠性。 3收集的标本用建立的PCR-SSP、PCR-RFLP方法检测52、54、57位密码子点突变。4收集的标本用ELISA法测定MBL含量。 结果： 1PCR-SSP测定MBL基因ExonⅠ52位密码予点突变方法的建立：①通过PCR扩增条件的优化选择，确定Mg2+浓度为1.6mmol/L、dNTPs浓度为0.8mmol/L、TaqDNA聚合酶浓度为0.08U/μl(均为反应终浓度)。②乙肝病毒和结核杆菌提取的DNA扩增未出现扩增带，人类基因组DNA出现预期扩增带。扩增结果出现两种情况：含有野生型引物的扩增体系有扩增带，含有突变型引物的扩增体系无扩增带；含有野生型引物和突变型引物的扩增体系均有扩增带。两种情况分别代表52位密码子为野生型和杂合突变型，电泳结果与测序结果一致。③5次重复测定结果一致。 2PCR-RFLP测定MBL基因ExonⅠ54、57位密码子点突变方法的建立：①通过PCR扩增条件的优化选择，确定Mg2+浓度为1.5mmol/L、dNTPs浓度为0.8mmol/L、TaqDNA聚合酶浓度为0.04U/μl(均为反应终浓度)、退火温度55℃。②乙肝病毒和结核杆菌提取的DNA扩增末出现扩增带，人类基因组DNA出现预期扩增带。③5次重复测定结果一致。④扩增产物用BanⅠ酶切后电泳出现三种情况：显示两条带，对应的DNA片断大小为236bp和94bp；显示三条带，对应的DNA片断大小为330bp、236bp和94bp；显示一条带，DNA片断大小为330bp，三种情况分别代表54位密码子为野生型、杂合突变型和纯合突变型。⑤扩增产物用MboⅡ酶切后结果出现一种情况，即显示一条带，DNA片断大小为330bp，代表57位密码予为野生型。不同类型标本酶切后电泳结果与测序结果一致。 352位密码子基因突变(TGT)频率：老年组和中青年组分别为0.6％和0.8％，确切概率P=0.801。 454位密码子基因突变(GAC)频率：老年组和中青年组分别为20.9％和16.4％。 557位密码子基因突变(GAA)频率：老年组和中青年组均为0％。 6血浆MBL含量测定结果：老年组(79例)和中青年组(64例)MBL含量分别为2,017±1，804μg/L,和2,523±1，955μg/L，t=1.641，P=0.109；老年组(49例)和中青年组(43例)(野生型)MBL含量分别为2,956±1，701μg/L和3,432±1，687μg/L,t=1.36,P=0.1775；老年组(30例)和中青年组(21例)(突变型)MBL含量分别为530±360μg/L和709±916μg/L,t=0.95,P=0.3448。 结论： 1本研究中建立的PCR-SSP和PCR-RFLP检测MBL基因ExonⅠ52、54和57化密码子点突变的方法，特异性强，重复性好，结果可靠。 252位密码子基因点突变频率：健康老年组与中青年组分别为0.6％和0.8％，二者点突变频率经统计学比较，确切概率P=0.801，差别无统计学意义。 354位密码子基因突变(GAC)频率：健康老年组和中青年组分别为20.9％和16.4％，健康老年组比中青年组偏高，但差别无统计学意义(x2=0.9266，P=0.336)。 457位密码子点突变频率：健康老年组和中青年组57位密码子点突变频率均为0％。 5血浆MBL含量：健康老年组MBL含量均值比中青年组偏低，但差别无统计学意义。

目录

摘要

引言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

结论

参考文献

综述 甘露糖结合凝集素的生物学和临床意义

致谢

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