黄曲霉毒素G诱发小鼠肺腺癌的组织发生及其对肺泡Ⅱ型上皮细胞影响的研究

摘要

黄曲霉毒素(Anatoxins，AF)是黄曲霉菌(Aspergillus flavus)等真菌产生的具有致癌作用真菌毒素，包括AFB<,1>、B<,2>、G<,1>、G<,2>和M<,1>等。黄曲霉毒素G<,1>(Aflatoxin G<,1>，AFG<,1>)在我国胃癌、食管癌高发区居民饮食中的检出率很高，是当地粮食主要的污染真菌毒素。 Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar type Ⅱ cell，AT-Ⅱ)是肺泡上皮损伤修复的干细胞。外源性致癌因素如吸烟、粉尘、石英等作用于肺组织可引起AT-Ⅱ损伤、修复和增生，在外源性致癌因素刺激长期反复作用下，AT-Ⅱ细胞可发生癌变而导致肺癌发生。 本研究室前期动物诱癌实验结果表明，AFG<,1>具有致肺癌性，经口给予AFG<,1>可诱发实验小鼠肺腺癌发生。目前有关AFG<,1>诱发肺腺癌研究还局限于长期动物诱癌实验及AFG<,1>诱发不同动物肺癌的验证方面，对AFG<,1>诱发实验动物肺腺癌的组织来源尚缺乏研究，AFG<,1>对实验动物肺组织及AT-Ⅱ的短期影响也未见文献报道。 为进一步探讨AFG<,1>诱癌机制，研究AFG<,1>诱发实验动物肺腺癌的组织学来源细胞类型，探讨AFG<,1>对肺组织和AT-Ⅱ的影响及其可能机制。本研究在前期动物诱癌实验研究的基础上，分析了AFG<,1>诱发肺腺癌组织AT-Ⅱ特异分化标志物SP-C和支气管无纤毛上皮细胞—C1ara细胞特异分化标志物CC-10表达情况；观察了在整体水平和细胞水平上AFG<,1>急性作用对大鼠肺组织和AT-Ⅱ结构和功能的影响及其致损伤生物学效应，同时探讨了JNK信号转导通路在AFG<,1>介导AT-Ⅱ损伤中的作用。 本研究论文共分为五个部分： 1 黄曲霉毒素G<,1>诱发小鼠肺腺癌组织发生的研究 目的：探讨长期经口给予AFG<,1>诱发NIH小鼠肺腺癌的组织学来源以及AFG<,1>长期作用对小鼠肺泡上皮细胞SP-C和PCNA 蛋白表达的影响。 方法：采用本实验室存档的AFG<,1>长期灌胃NIH小鼠58周后存活小鼠肺组织取材石蜡包埋组织块标本24例作为研究对象，其中 AFG<,1>诱发的肺腺癌9例。以同期实验中灌喂生理盐水的12例NIH小鼠正常肺组织作为对照。采用免疫组化方法检测9例肺腺癌组织中SP-C、CC-10、P53和RasP<'21>的表达情况。同时，采用免疫组化方法检测不同剂量AFG<,1>长期灌胃组和对照组肺组织肺泡上皮细胞SP-C和PCNA蛋白的表达情况。 2 支气管内给予黄曲霉毒素G<,1>对大鼠肺组织的作用的研究 目的：探讨一次性支气管内给予 AFG<,1>对大鼠肺组织的影响。 方法：按30μg/kg body weight剂量经支气管一次性给予雄性SD大鼠AFG<,1>处理。AFG<,1>处理1、3、7和14d后，分别处死实验动物。部分大鼠支气管插管收集支气管.肺泡灌洗液(BALF)，离心10min收集上清，采用生化法检测乳酸脱氢酶(LDH)和碱性磷酸酶(AKP)活力。分别切取实验大鼠肺组织进行如下研究工作：取1mm<'3>大小的肺组织标本经2.5％戊二醛固定标本24h后，以扫描电镜方法观察大鼠肺组织超微结构变化；取部分肺组织4％多聚甲醛固定4h后，常规石蜡切片制备，采用原位杂交方法检测肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA的表达情况；取部分肺组织10％多聚甲醛固定，常规石蜡切片制备，按S-P 法进行采用免疫组化方法检测核因子-kB(NF-kB)蛋白的表达；取部分肺组织用生理盐水制备成10％的肺匀浆，采用活性氧(ROS)测定法按相应试剂盒操作程序检测肺组中ROS(以H<,2>O<,2>为代表)含量。 3 支气管内给予黄曲霉毒素G<,1>对大鼠肺组织肺泡Ⅱ型上皮细胞影响的研究 目的：探讨一次性支气管给予AFG<,1>对大鼠肺组织Ⅱ型肺泡上皮细胞(AT-Ⅱ)结构和功能的影响 方法：实验动物模型同前一部分。AFG<,1>处理1、3、7和14d后，分别处死实验动物，切取部分新鲜肺组织，分别进行如下研究，取1mm<'3>大小的新鲜肺组织固定于4％戊二醛中，待制备透射电镜电镜标本，观察AT-Ⅱ超微结构变化；取部分肺组织10％多聚甲醛固定，常规石蜡切片制备，参照试剂盒说明书按S-P法进行采用免疫组化方法检测SP-C蛋白的表达；部分肺组织固定于70％酒精，采用FCM检测SP-C蛋白的表达；取100mg肺组织加入 500μL 蛋白裂解液，提取肺组织总蛋白，Westem blot方法检测SP-C蛋白的表达；部分肺组织液氮冻存，提取组织RNA，RT-PCR方法检测SP-C和SP-A mRNA的表达情况。 4 黄曲霉毒素G<,1>对体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞影响的研究 目的：进一步探讨AFG<,1>对体外培养的大鼠AT-Ⅱ致损伤作用。 方法：以酶消化法原代分离、培养大鼠 AT-Ⅱ，将10～15mL 细胞悬液接种于0.1 g·L<'-1>大鼠IgG处理后的平皿中纯化3h，纯化后AT-Ⅱ用20％DMEM 调整细胞浓度为(1～2)×10<'9>L<'-1>，接种于96孔板、24孔板和细胞培养瓶中培养24h。用10％DMEM换液后继续培养12h，实验组分别给予不同浓度(0.5，1.0和2.0mg·L<'-1>)的 AFG<,1>处理，溶剂对照组和对照组给予DMSO(0.4mL·L<'-1>)和生理盐水处理。AFG<,1>作用24h后，收集96孔板细胞采用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞存活率；收集24孔板培养基上清液，采用生物化学方法检测上清液乳酸脱氢酶(LDH)和碱性磷酸酶(AKP)活力；离心收集细胞于2.5％戊二醛中前固定24h，超薄切片(厚度50nm)，醋酸铀.柠檬酸铅染色，日立H-7500透射电镜观察 AT-Ⅱ超微结构的改变；收集24孔板细胞，Fluo-3/AM负载40min，采用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)检测细胞内[Ca<'2+>]；收集24孔板细胞，采用免疫细胞化学、CLSM方法检测AT-Ⅱ SP-C的表达；离心收集细胞于 70％酒精固定，采用FCM方法检测AT-Ⅱ SP-C蛋白表达。 5 JNK 信号转导通路在黄曲霉毒素G<,1>诱导A549细胞损伤中的意义 目的：探讨JNK信号转导通路在AFG<,1>诱导A549细胞损伤中的作用及其机制。 方法： 5.1 AFG<,1>处理24h对A549细胞毒性作用、JNK激酶活性、SP-C 表达及细胞内[Ca<'2+>]影响的检测 A549细胞复苏培养后，取对数生长期A549细胞，用10％DMEM调整细胞浓度为(1-2)×10<'8>L<'-1>，接种于96孔板。实验按AFG<,1>处理8、16、24和48h不同时间分为4个时间点，每个时间点按0.1、0.5、1.0 和2.0mg·L<'-1>AFG<,1>依次给予AFG<,1>处理、溶剂对照组和对照组分别给予DMSO(0.4mL·L<'-1>)和生理盐水处理。以MTT比色法检测 AT-Ⅱ存活率。 5.2 JNK抑制剂SP600125预处理对AFG<,1>诱导细胞毒性作用、INK 激酶活性和SP-C 表达变化影响的检测 取对数生长期A549细胞用10％DMEM调整细胞浓度N(1～2)×10<'8>L<'-1>，接种于96孔培养板，随机分为9组：溶剂对照组、对照组、1μM SP600125组、0.5μM SP600125组、0.1μM SP600125组、1μM SP600125+AFG<,1> 1.0mg·L<'-1>组、0.5μM SP600125+AFG<,1>1.0 mg·L<'-1>组、0.1μM SP600125+AFG<,1>1.0 mg·L<'-1>组和AFG<,1>1.0 mg·L<'-1>组。细胞培养24h后，更换2％低血清DMEM培养基，溶剂对照组和对照组给予DMSO(0.4mL·L<'-1>)和生理盐水处理。 结论： 1.长期经口灌胃NIH小鼠AFG<,1>所诱发的肺腺癌组织来源于AT-Ⅱ，肺腺癌组织中未见突变型P53和Ras P21蛋白表达；AFG<,1>长期经口灌胃NIH小鼠促进肺泡上皮细胞SP-C和PCNA的表达。 2.急性支气管给予AFG<,1>可以增加处理大鼠BALF中LDH和AKP的活力，导致大鼠肺组织超微结构出现损伤性变化；激活肺泡细胞 TNF-αmRN'A的表达，降低肺组织抗活性氧能力，但对肺组织NF-kB蛋白的表达没有影响。 3.急性支气管给予AFG<,1>可时间特异性地降低大鼠肺组织SP-C在蛋白水平上的表达，降低SP-C和SP-A在mRNA水平的表达。 4.AFG<,1>对原代培养的大鼠AT-Ⅱ具有明显的致损伤作用，可以增加大鼠AT-Ⅱ细胞内[Ca<'2+>]，降低原代培养的大鼠 AT-Ⅱ SP-C蛋白的表达。 5.AFG<,1>作用于A549细胞可以增加A549细胞内[Ca<'2+>]、激活JNK蛋白激酶、降低A549细胞SP-C mRNA的表达；给予JNK特异性阻断剂-SP600125预处理可以部分抑制AFG<,1>对A549细胞的细胞毒性作用，但对AFG<,1>诱导SP-C mRNA表达降低没有影响。JNK 信号转导通路可能部分参与介导AFG<,1>致AT-Ⅱ损伤生物学作用。

目录

论文说明：英文缩写

摘要

引言

第一部分黄曲霉毒素G1诱发的小鼠肺腺癌组织发生的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分支气管内给予黄曲霉毒素G1对大鼠肺组织的作用的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分支气管内给予AFG1对大鼠肺组织肺泡Ⅱ型上皮细胞影响的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分黄曲霉毒素G1对体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞影响的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第五部分JNK信号转导通路在黄曲霉毒素G1诱导A549细胞损伤中的意义

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

综述环境致癌物诱导肺损伤反应中表面分泌蛋白的作用的研究

致谢

个人简历