RNAi在胰腺癌基因治疗中的交叉抑制性效果研究

摘要

目的：构建表达短发卡RNA(shRNA)的质粒载体，观察其在K-ras基因突变类型为GAT和GTT的人胰腺癌细胞株PANC-1和CFPAC-1间的交叉抑制效果，为RNAi技术应用于治疗胰腺癌奠定一定的理论和实验基础。 方法： 1、针对GAT和GTT两种K-ras基因突变类型，分别设计两条shRNA序列，并分别加载到质粒载体pGenesil-1上，构建针对人胰腺癌细胞株PANC-1和CFPAC-1的K-ras基因的质粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT。 2、应用质粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬时转染K-ras突变类型为GAT的人胰腺癌细胞株PCNA-1，同时将质粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬时转染具有K-ras突变类型为GTT的人胰腺癌细胞株CFPAC-1。每种细胞分4组，分别为特异性抑制组，交叉性抑制组，空白质粒组和对照组，其中特异性抑制组转染同细胞K-ras基因突变类型相同的质粒，交叉性抑制组转染与其K-ras基因突变类型不同的质粒，空白对照组转染空白质粒pGenesil-1KB，对照组以1×PBS转染作为对照。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Western-blot)方法检测转染后细胞K-ras基因的表达情况，并采用CCK-8(ceIl counring kit-8)活细胞计数法，绘制转染前后细胞的生长曲线，以检测质粒pGenesil-1GAT对胰腺癌细胞PANC-1的K-ras基因的抑制效果和质粒pGenesil-1GTT对PANC-1细胞的交叉抑制效果，以及质粒pGenesil-1GTT对胰腺癌细胞CFPAC-1的K-ras基因的抑制效果和质粒pGenesil-1GTT对CFPAC-1细胞的交叉抑制效果。 结果： 1、通过酶切鉴定和送检基因测序证实插入shRNA序列正确，成功构建了质粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT。 2、将质粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬时转染到PANC-1细胞后，PANC-1特异性抑制组(转染pGenesil-1GAT的细胞)细胞的K-ras基因mRNA和蛋白表达水平明显下降，与交叉抑制组(转染pGenesil-1GTT的细胞)相比结果有显著性差异(p<0.05)，与转染空白质粒组(转染pGenesil-1KB的细胞)相比结果有显著性差异(p<0.05)，与对照组相比结果亦有显著性差异(p<0.05)，细胞生长明显受限，对数生长期后移，平台期水平低，细胞生长曲线明显向右下移动，而PANC-1细胞交叉抑制组(转染pGenesil-1GTT的细胞)的K-ras基因mRNA和蛋白表达水平下降不明显，与转染空白质粒组(转染pGenesil-1KB的细胞)相比结果无显著性差异(p>0.05)，与未转染的空白对照组最相比结果亦无显著性差异(p>0.05)。细胞生长未见明显影响。 3、将质粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬时转染到CFPAC-1细胞后，特异性抑制组(转染pGenesil-1GTT的细胞)K-ras基因mRNA和蛋白表达水平明显下降，与交叉抑制组(转染pGenesil-1GAT的细胞)相比结果有显著性差异(p<0.05)，与空白质粒组(转染pGenesil-1KB的细胞)相比结果有显著性差异(p<0.05)，与对照组相比结果亦有显著性差异(p<0.05)，细胞生长亦明显受限。而交叉抑制组(转染pGenesil-1GAT的细胞)K-ras基因mRNA和蛋白表达水平下降不明显，与空白质粒组(转染pGenesil-1KB的细胞)相比结果无显著性差异(p>0.05)，与对照组相比结果亦无显著性差异(p>0.05)，细胞生长未受影响。 结论： 1、针对胰腺癌细胞K-ras基因突变位点设计的shRNA能够有效地加载到pGencsil-1质粒载体上，并且重构的质粒载体都可以高效的转染人胰腺癌细胞株PANC-1和CFPAC-1。 2、突变特异性的shRNA可以特异性的抑制相应突变类型的K-ras基因的表达，从而达到抑制具有相应K-ras基因突变类型的人胰腺癌细胞生长的目的，说明K-ras基因在肿瘤细胞增殖方面起到非常重要的作用，因此应用RNA干扰技术治疗胰腺癌是可行的。 3、针对K-ras突变类型GAT和GTT所设计的两条shRNA序列，无相互交叉抑制现象的出现，这说明质粒载体介导的RNAi特异性非常强，一般不会出现碱基错配现象，这为RNAi应用于胰腺癌的基因治疗提供了更加全面的数据。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 RNAi在肿瘤基因研究中的现状

致谢

个人简历