对非核苷类逆转录酶抑制剂耐药型HIV-1药理模型的建立

摘要

艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症(AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(HIV)所引起的致命性慢性传染病。HIV主要侵犯、破坏辅助性T淋巴细胞，导致机体细胞免疫功能受损，最后并发各种严重机会性感染和肿瘤。 艾滋病目前尚无特效治疗方法，早期抗病毒治疗是关键。既能缓解病情，减少机会性感染和肿瘤，又能预防或延缓AIDS相关疾病的发生，延长生存期，提高生活质量。根据HIV生命周期中的主要环节，抗HIV药物分为逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂和融合抑制剂四大类。逆转录酶抑制剂是最早用于临床的抗HIV药物，包括核苷类和非核苷类两种。其中非核苷类逆转录酶抑制剂由于其低毒高效而受到关注，但由于其抗耐药屏障作用较弱，使得这类药物在应用一段时间后很容易发生耐药。因此，研究和开发具有抗耐药作用的新型非核苷类药物成为发展方向，而与之相应的药物筛选方法成为关键环节。 目的：在细胞水平建立三种针对HIV-1复制环节的药物筛选模型，其对现有的非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)具有特异的耐药性，可为新型NNRTIs研发提供筛选平台。 方法： (1)应用PCR法扩增含突变位点K103N，K103N/P225H，K103N/G190A的三段目的片段，长度为1.5Kb，介于apaI与AgeI酶切位点间。 (2)用限制性内切酶ApaI和Agel分别切割目的片段和HIV-1质粒。 (3)T4连接酶将含相同粘末端的目的片段与HIV-1质粒进行连接，构建新的含突变位点的HIV-1质粒，分别命名为HIV-K103N、HIV-K103N/P225H、HIV-K103N/G190A。 (4)将HIV-K103N、HIV-K103N/225H、HIV-K103N/G190A分别与水泡性口膜炎病毒的外壳糖蛋白的质粒(VSV-G)在293细胞中共转染，组装成假病毒模型，分别命名为VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV-K103M225H、VSVG/HIV-K103N/G190A，模型携带的荧光素酶报告基因的表达水平可以反映HIV-1的复制程度。 (5)对三种假病毒模型按不同的稀释比(1:10，1:25，1:50，1:100，1:200和1:400)稀释后感染293细胞，用FB15荧光检测器测定细胞中荧光素酶的相对活性(RLUs)，并绘制病毒滴度-荧光素酶相对活性曲线。 (6)用核苷类阳性对照药齐多夫定(AZT)和司他夫定(d4T)；非核苷类阳性对照药奈韦拉平(NVP)和依非韦伦(EFV)分别对三种假病毒模型进行抑制性检测，并用野生株HIV-1假病毒作对照，验证模型的可靠性。 结果： (1)通过PCR成功扩增出1.5Kb的目的片段，再通过分子克隆方法构建新的HIV-1质粒(HIV-K103N、HIV-K103N/P225H、HIV-K103N/G190A)，经过DNA测序分析证实突变引入成功。 (2)对假病毒模型滴度检测证实三种假病毒都具有高度感染能力，VSVG/HIV-K103NT和VSVG/HIV-K103N/P225H按1:10稀释后感染293细胞，其RLUs达到3×107，这也是FB15荧光检测器的最大检测值；VSVG/H/V-K103N/G190A按1:10稀释后感染293细胞，其RLUs也达到2×107。病毒滴度-荧光素酶相对活性曲线可以清楚的反应出HIV-1复制水平与荧光素酶报告基因表达水平间的剂量依赖效应。因此，三种假病毒可用于针对HIV-1复制环节的药物筛选模型。 (3)VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV-K103N/P225H和VSVG/HIV-K103N/G190A以及VSVG/HIV-wild可有效的在细胞内进行复制，非核苷类阳性对照药NVP和EFV可有效抑制VSVG/HIV-wild，其IC50分别为0.024±0.006μmol/L和0.83±0.21nmol/L，与文献中应用其它方法得出的IC50(0.046μmol/L和1.3 nmol/L)基本一致。NVP也可有效抑制 VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV-K103N/P225H和VSVG/HIV-K103N/G190A，但IC50明显升高，分别为1.89±0.92μmol/L、5.13±0.58μmol/L和27.61±4.796μmol/L，与文献中应用其它方法得出的IC50(2.21μmol/L、6.12μmol/L和23μmol/L)相一致。EFV也可有效抑制VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV-K103N/P225H和VSVG/HIV-K103N/G190A，IC50也明显升高，分别为16.7±6.0nmol/L、0.1103±0.0328μmol/L和0.1697±0.1147μmol/L，与文献中应用其它方法得出的IC50(26nmol/L、0.1742μmol/L和0.277μmol/L)相符合。计算三种假病毒对NVP和EFV的耐药倍数(耐药株病毒IC50野生株病毒IC50)，为15～1000倍，说明此三种假病毒模型对NNRTIs产生耐药性。 (4)核苷类阳性对照药AZT和d4T可有效抑制VSVG/G/HIV-K103N、VSVG/HIVK103N/P225H和VSVG/HIV-K103N/G190A以及VSVG/HIV-wild，其IC50未有明显变化，约为9.9±1.4nmol/L和0.153±0.034μmol/L，与文献中报道的活病毒IC50，以及实验室应用其它方法得出IC50相符合，说明此三种假病毒模型对NRTIs不产生耐药性。 结论： HIV-1假病毒模型是针对HIV-1复制环节的细胞水平药理筛选模型，其携带的荧光报告基因的表达水平可以反映HIV-1复制的程度；通过PCR及分子生物学方法将文献报道的针对NNRTIs耐药的K103N、K103N/P225H和K103N/G190A三组突变位点定点引入HIV-1假病毒模型，构建出新的假病毒模型；通过核苷类及非核苷类阳性对照药对模型的验证，证实模型对NNRTIs有特异的耐药性，可为新型非核苷类化合物的研发提供一个安全、高效、稳定、快速的筛选平台。

目录

声明

摘要

前言

实验材料

实验方法

结果

附图

附表

讨论

参考文献

综述 HIV-1逆转录酶耐药性的研究现状

致谢

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