TRAIL的耐药机制及其上调MM细胞表面粘附分子CXCR4表达和分子机制的初步探讨

摘要

目的：多发性骨髓瘤（Mutipie myeloma，MM）是骨髓中浆细胞异常增生性的恶性肿瘤。虽然近年来MM的治疗取得了长足进展，但是MM仍然是一种不能治愈的肿瘤。因此有必要探索更加有效的治疗药物。
　　 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor Necrosis Factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）是肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）超家族成员。已有实验证实，TRAIL能迅速诱导肿瘤细胞凋亡，而对大多数正常组织细胞没有毒性。因此，TRAIL用于肿瘤治疗的可能性激起许多研究者的兴趣。此前我们也已经证实在一定浓度范围内，TRAIL对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226的生长起抑制作用，并且这种抑制呈时间剂量依赖性。趋化因子受体CXCR4（CXC Chemokine Receptor-4）是G蛋白偶联受体的家庭成员，其配体为基质细胞衍生因子SDF-1。它广泛表达于造血和非造血肿瘤细胞中，不仅参与维持正常造血细胞的存活和增殖，同时与恶性造血细胞的增殖以及在血液、骨髓、淋巴结的浸润密切相关。我们用流式细胞术也证实了TRAIL，可以上调人骨髓瘤细胞株RPMI8226表面粘附分子CXCR4的表达。
　　 本研究是在前期研究的基础上进行的，以人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266为研究对象，从两个方面对TRAIL进行研究：第一，TRAIL对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226表面粘附分子CXCR4表达的影响及其分子机制的初步探讨；第二，TRAIL的耐药机制即不同细胞株RPMI8226和U266对TRAIL的不同敏感性及其TRAIL受体表达的差异。从而进一步探讨TRAIL对人多发性骨髓瘤的作用机制，为本药的临床应用奠定理论基础。
　　 方法：1.细胞培养和传代
　　 人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266细胞株，培养于含20％灭活胎牛血清（FBS）、100U/ml的青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的RPMI1640培养液中，置37℃、体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中培养，每5～6天传代1次，实验用对数生长期的细胞。
　　 2.TRAIL对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞表面粘附分子CXCR4表达的影响
　　 2.1流式细胞术检测TRAIL对RPMI8226细胞表面粘附分子CXCR4表达的影响
　　 取对数生长期的RPMI8226细胞，调整细胞密度为2×105/ml，接种于24孔培养板，加入不同浓度TRAIL作用24h后，收集细胞，用冷PBS洗两遍后，各取细胞悬液100μl，分别加入CD184（CXCR4单抗）6μl，对照组加入CD46μl，轻轻混匀，室温避光反应30分钟，立即在流式细胞仪（FACSallibur）上检测，计数104细胞，以对照管作为阴性对照，CELLQuest软件分析，粘附分子CD184表达水平以阳性细胞百分数表示。
　　 2.2半定量逆转录-聚合酶链反应方法检测不同浓度TRAIL作用于RPMI8226细胞12h、24h和48h CXCR4 mRNA表达的变化
　　 2.3实时荧光定量PCR方法检测不同浓度TRAIL作用于RPMI8226细胞12h、24h和48h CXCR4 mRNA表达的变化
　　 2.4 Western blot方法检测不同浓度TRAIL作用于RPMI8226细胞24h CXCR4蛋白表达的变化
　　 3.TRAIL对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞表面粘附分子CXCR4表达的影响与NF-κB的相关性
　　 3.1半定量逆转录-聚合酶链反应方法检测不同浓度TRAIL作用于RPMI8226细胞12h、24h和48h NF-κB mRNA表达的变化
　　 3.2实时荧光定量PCR方法检测不同浓度TR-AIL作用于RPMI8226细胞12h、24h和48h NF-κB mRNA表达的变化
　　 3.3 Western blot方法检测不同浓度TRAIL作用于RPMI8226细胞24h NF-κB蛋白表达的变化
　　 4.人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226与U266对TRAIL的不同敏感性及TRAIL受体表达差异的比较
　　 4.1倒置相差显微镜下观察不同浓度的TRAIL作用不同时间，RPMI8226与U266细胞的形态学变化
　　 4.2半定量逆转录-聚合酶链反应方法检测不同细胞株RPMI8226与U266细胞中TRAIL受体mRNA表达的差异
　　 4.3实时荧光定量PCR方法检测不同细胞株RPMI8226与U266细胞中TRAIL受体mRNA表达的差异
　　 结果：
　　 1.TRAIL对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞表面粘附分子CXCR4表达的影响
　　 1.1流式细胞术检测TRAIL作用于RPMI8226细胞24h，随着TRAIL浓度的增加细胞表面CD184表达率呈升高趋势。
　　 1.2半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测TRAIL作用于RPMI8226细胞12h和24h，随着TRAIL浓度的增加细胞表面粘附分子CXCR4 mRNA表达水平呈升高趋势。而TRAIL作用于RPMI8226细胞48h，随着TRAIL浓度的增加细胞表面粘附分子CXCR4 mRNA表达水平无明显差异。
　　 1.3 Western blot检测TRAIL作用于RPMI8226细胞24h，随着TRAIL浓度的增加细胞表面粘附分子CXCR4蛋白的表达水平呈升高趋势。
　　 2.TRAIL对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞表面粘附分子CXCR4表达的影响与NF-κB途径存在相关性
　　 2.1半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测TRAIL作用于RPMI8226细胞12h和24h，随着TRAIL浓度的增加NF-κBmRNA表达水平呈下降趋势。而TRAIL作用于RPMI8226细胞48h，随着TRAIL浓度的增加NF-κB mRNA表达水平无明显差异。
　　 2.2 Western blot检测TRAIL作用于RPMI8226细胞24h，随着TRAIL浓度的增加NF-κB蛋白的表达水平呈下降趋势。
　　 3.人多发性骨髓瘤细胞株对TRAIL的敏感性与其相关受体表达水平有关
　　 3.1倒置相差显微镜观察可见RPMI8226细胞经TRAIL作用后，表现为部分细胞悬浮，折光性减低，细胞体积变小、变形。随着药物浓度的增加及药物作用时间的延长，凋亡细胞的数量增加。而U266细胞随着TRAIL浓度的增加及作用时间的延长，其形态并无明显变化。
　　 3.2半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测不同细胞株RPMI8226与U266中TRAIL受体的表达存在着差异。TRAIL受体DR5 mRNA在RPMI8226中的表达水平高于U266中的表达；而TRAIL受体DcR1 mRNA在U266中的表达水平高于RPMI8226中的表达。
　　 结论：
　　 1.TRAIL能上调人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞表面粘附分子CXCR4的表达水平。
　　 2.TRAIL上调RPMI8226细胞表面CXCR4表达的机制可能与NF-κB途径相关。
　　 3.TRAIL对MM细胞有选择性毒性作用，TRAIL可抑制人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞的生长，但对U266细胞无此作用。TRAIL可通过DR5受体诱导的凋亡途径诱导人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞凋亡，而U266细胞则可通过DcR1受体干扰凋亡信号传导，从而对TRAIL耐药。

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综述 趋化因子SDF-1及其受体CXCR4

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