大鼠骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共培养及对糖尿病大鼠的治疗

摘要

目的：对大鼠骨髓间充质干细胞（Borle Marrow Mesench-ymal Stem Cells，BMSCs）进行分离培养、体外扩增，与大鼠胰岛细胞共培养分化为胰岛样细胞，采用双硫腙染色对诱导分化的胰岛样细胞进行鉴定、化学发光法检测其胰岛素水平。将共培养后的细胞及未经共培养的MSCs通过尾静脉移植入糖尿病大鼠体内，通过对血糖的检测，观察其对糖尿病大鼠的治疗效果。
　　 方法：
　　 1、取3-4周龄的雄性SD大鼠，采用percoll密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化BMSCs，传代扩增，倒置相差显微镜下进行形态学观察。取第4代细胞与胰岛细胞共培养，按实验分为3组：①PBS组；②BMSCs组；③BMSCs和胰岛细胞共培养组。
　　 2、取3-4周龄的雄性SD大鼠，采用逐级消化及筛网过滤方法分离纯化胰岛细胞，双硫腙染色证明所收集的细胞为胰岛细胞。
　　 3、对共培养后细胞进行鉴定：倒置相差显微镜观察细胞形态学变化；双硫腙染色法对共培养细胞进行鉴定；化学发光法检测MSCs组与MSCs和胰岛细胞共培养组细胞对葡萄糖刺激试验的反应；RT-PCR检测共培养组细胞pdx-1的表达。
　　 4、将18只雄性SD大鼠通过腹腔注射链脲佐菌素破坏胰腺造成糖尿病大鼠模型，分为：PBS组、MSCs组、MSCs与胰岛细胞共培养组。将Brdu标记的细胞从尾静脉移植入糖尿病大鼠模型体内，观察临床疗效，免疫组织化学染色确定Brdu标记的细胞及胰岛素抗体在胰腺的分布。
　　 结果：
　　 1、MSCs接种初期可见大量悬浮细胞，24小时后观察大部分细胞开始贴壁。贴壁生长的细胞呈单个分散存在或形成数个细胞克隆，逐渐伸脚变形，呈圆形、多角形、长梭形等多种形态。传至第3代，细胞纯化，形态较为单一，呈长梭形贴壁生长，以平行排列为主或呈漩涡状生长。
　　 2、胰岛细胞呈圆形或椭圆形，大小不一，外包完整而清晰的被膜而形成细胞团，即为胰岛。培养3天前，细胞呈团锁状结构。4-7天时，形成均一的单层细胞，集聚生长，生长状态良好。培养7天后，细胞碎片逐渐增多。双硫腙染色镜下观察细胞团被染成棕红色，证明所收集的细胞为胰岛细胞。
　　 3、取更为纯化的第4代MSCs与胰岛细胞共培养，第3天时MSCs形态略有变化，但大多数仍为长梭形，极少数呈多角形或圆形，折光性明显增强，第6天变圆的MSCs明显增多，大部分形成细胞团，第9天进一步增多。
　　 4、双硫腙染色检测MSCs与胰岛细胞共培养组细胞胰岛素的合成。光学显微镜下观察大部分细胞团被染成棕红色，而MSCs组则无染色，表明共培养的细胞胞浆中富含锌离子，证明胰岛素分泌细胞的存在。
　　 5、MSCs与胰岛细胞共培养组经低糖和高糖刺激后用化学发光法检测有胰岛素分泌，且经高糖刺激后胰岛素分泌量高于低糖刺激，差异具有统计学意义（P<0.01），而MSCs组则无胰岛素分泌。
　　 6、RT-PCR检测MSCs组与MSCs和胰岛细胞共培养组细胞pdx-1的表达。MSCs组细胞不表达pdx-1，MSCs和胰岛细胞共培养组3天的细胞表达pdx-1，6天时pdx-1表达进一步增高，14天无pdx-1表达。
　　 7、腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）3天后检测大鼠血糖。造模组大鼠血糖≥16.7mmol/L且稳定两天，并可观察到大鼠出现多饮、多尿等症状，可判定大鼠糖尿病模型造模成功。各组大鼠糖尿病模型均造模成功。
　　 细胞移植后用血糖仪检测大鼠尾静脉血糖，PBS组血糖较移植前无明显下降（P>0.05），MSCs组及共培养组血糖移植后14天血糖开始下降，与移植前相比，差异有统计学意义（P<0.01），共培养组移植后血糖较MSCs组血糖下降明显，差异具有统计学意义（P<0.01）。并可观察到MSCs及共培养组大鼠多饮、多食、多尿症状改善，皮毛干净，反应灵敏，垫料干燥。
　　 8、免疫组织化学方法检测移植后Brdu标记细胞及胰岛素抗体在糖尿病大鼠胰腺的分布，MSCs组及共培养组Brdu标记的细胞在细胞核显色，为棕黑色。其相应的胰岛素表达阳性，主要显色在胞浆，为棕红色。在PBS组胰腺未发现Brdu标记细胞及胰岛素表达阳性。
　　 结论：
　　 1、通过密度梯度离心法及贴壁筛选法联合应用去除杂细胞效果好，在体外可获得纯化的BMSCs。
　　 2、通过逐级消化、转瓶及筛网过滤方法可得到数量较多及纯化的胰岛细胞，培养至3-7天时，适于体外实验研究。
　　 3、大鼠MSCs与胰岛细胞共培养后可分化为胰岛样细胞，且对葡萄糖刺激出现反应，初步具有模拟体内β细胞的生理功能。
　　 4、与胰岛细胞共培养的BMSCs尾静脉移植入糖尿病大鼠体内，可降低大鼠血糖水平。
　　 5、未经与胰岛细胞共培养的BMSCs尾静脉移植入糖尿病大鼠体内，可降低大鼠血糖水平，但血糖下降程度较经共培养的BMSCs小。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共培养后的观察与鉴定

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 骨髓间充质干细胞及其与胰岛细胞共培养后的细胞移植治疗糖尿病大鼠

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病的研究进展

致谢

个人简历