大鼠蛛网膜下腔出血后大脑皮层超微结构改变及COX-4在神经细胞能量代谢中的表达研究

摘要

蛛网膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage，SAH）多由动脉瘤破裂出血引起。脑血管痉挛（Cerebral vasospasm，CVS）是蛛网膜下腔出血常见和严重的并发症，发生率高达70％，常引起严重的局部脑组织缺血或迟发性脑损伤，甚至导致脑梗死，成为致死或重残的主要原因。目前普遍认为SAH后血液弥散至蛛网膜下腔导致了脑血管痉挛和缺血性神经功能的障碍，但是对SAH后神经细胞的能量代谢及CVS的病理生理机制没有完全研究清楚。对于脑缺血机制的研究主要集中在大血管痉挛方面，但是这种脑血管痉挛不能完全解释迟发性脑缺血的神经功能障碍，大脑微动脉的障碍可能在SAH后的神经细胞能量代谢和脑缺血中起了重要的作用。然而，SAH后大脑微循环的改变存在争议。
　　 细胞色素C氧化酶调节亚基4（Cytochrome c oxidase4，COX-4）是线粒体呼吸链中的一个关键组成部分。COX-4是由nDNA编码的调节亚基，它在10个由nDNA编码的亚基中分子最大（MW约17kD），是其中一个很重要的核编码的亚单位，它们在胞浆中合成后输入线粒体内，与mtDNA编码的亚基装配形成全酶，COX-4具有COX4-1和COX4-2两种异构体，主要起到结合ATP，使细胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase，COX）的活性在ATP/ADP比例升高时出现变构性抑制，从而起到调节作用，进而对神经细胞的能量代谢起到至关重要的作用。但是COX-4在蛛网膜下腔出血后神经细胞的能量代谢中的表达鲜见报道。
　　 目的：通过建立血管内穿刺法大鼠蛛网膜下腔出血模型，应用光镜和透射电镜（transmission electron microscopy，TEM）观察模型组不同时相的大脑皮层神经元、线粒体及微血管的病理形态学及超微结构的变化特点，为研究SAH后神经细胞的能量代谢及CVS的发生机制提供形态学资料。通过免疫组织化学染色观察COX-4的在大鼠的SAH模型中的表达情况，探讨COX-4在SAH后神经细胞能量代谢中的表达规律，以及其表达与形态学变化之间的关系，为临床预防、缓解与治疗SAH后CVS提供实验依据。
　　 方法：
　　 1.成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠66只，体重260-280g。随机分为3组，正常组6只，假手术组6只，手术组45只，按造模时间再分为术后1h、3h、6h、9h、12h、24h、48h、5d、7d组共9组，每组各6只。手术组采用血管内穿刺法制作SAH模型，假手术组仅做血管内穿刺，不刺破大脑前动脉与大脑中动脉分叉。
　　 2.各组动物麻醉后，经左心室灌注多聚甲醛固定后取脑。观察各组脑组织的大体形态，各组蛛网膜下腔血液分布情况。透射电镜观察线粒体、大脑皮层及微血管的超微结构变化。
　　 3.免疫组织化学染色检测SAH后神经细胞中COX-4在蛋白水平的表达：免疫组化步骤按试剂盒说明进行操作。在光学显微镜高倍镜（10×40倍）视野下观察阳性细胞。
　　 结果：
　　 1.脑组织大体观手术组：术后1h-3h组可见颈动脉池、视交叉池和基底池明显积血，大脑凸面蛛网膜下腔少量积血。3h-24h组可见蛛网膜下腔的积血由脑底面向脑表面扩散，大脑凸面蛛网膜下腔血液弥散范围逐渐增大，24-48h组脑凸面及颅底面的蛛网膜下腔的血液较前减少，第四脑室可见明显积血。5d组仅基底池可见少量血凝块。7d组蛛网膜下腔的血液基本消失。正常组和假手术组开颅未见蛛网膜下腔有血液。
　　 2.大脑皮层及微血管的超微结构观察手术组：神经元和血管内皮细胞的超微结构的改变主要是细胞核内染色质边集、浓缩，异染色质增多，胞质内线粒体肿胀、嵴紊乱、溶解呈空泡，粗面内质网扩张，脱颗粒现象。血管内皮细胞间紧密连接消失，细胞核内染色质浓缩，线粒体肿胀、嵴紊乱，管腔狭窄甚至闭塞。在SAH后1 h时可发现超微结构的改变，从6h开始明显的结构改变，在12h至48h结构变化最明显。正常对照组及假手术组：神经元及血管内皮细胞未见异常。
　　 3.COX-4蛋白在SAH后大鼠神经细胞能量代谢中的表达手术组：于1h组开始大脑皮层神经元开始出现大量的COX-4的强阳性表达，并且达到高峰。与对照组比较有明显统计学意义。此后表达开始降低，SAH后12h组的COX-4的阳性表达较SAH后1h组有所减少，但与对照组比较仍有统计学意义。降至24h后出现第一个最低点，而后又开始表达增强，到48h后又出现一个表达小高峰。随后开始下降，直到7d组的COX-4的阳性表达与对照组比较差别无显著性。假手术组与正常组偶见COX-4阳性表达，二者比较差别无显著性。
　　 结论：
　　 1.SAH后神经细胞能量代谢障碍以及微循环功能的障碍可能是造成SAH后缺血性神经功能损害的直接原因。
　　 2.SAH后大脑皮层神经元的COX-4表达明显增加，在SAH后的脑缺血缺氧的病理过程中起了十分重要的作用。

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综述脑血管痉挛与神经细胞的能量代谢

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