神经元M通道、Na通道、TRPV1通道功能调节及神经元兴奋性调节的研究

摘要

本实验分别以原代培养的SD大鼠的SCG神经元和DRG神经元为研究平台，对神经元兴奋性及影响神经元兴奋性的M通道、Na通道（SCG神经元）和TRPV1通道（DRG神经元）的功能调节及相关机制进行了研究。
　　 一、神经生长因子抑制M/KCNQ电流并增强SCG神经元的兴奋性
　　 目的：在大鼠SCG神经元分别记录M/KCNQ电流和神经元动作电位，观察神经生长因子（nerve growth factor，NGF）对M/KCNQ电流和神经元动作电位的调节作用，并进行二者相关性研究及M/KCNQ电流调节机制的研究。
　　 结论：（1）从电生理特性看，根据大鼠SCG神经元神经元所表达的M/KCNQ电流密度的大小可将神经元分为Phasic-1、Phasic-2和Tonic三种神经元。Phasic-1和。Phasic-2神经元表达M/KCNQ电流密度大，稳定膜电位作用较强，故其兴奋性较低，不易爆发动作电位；Tonic神经元表达M/KCNQ电流密度小，稳定膜电位作用较弱，故其兴奋性较高，较易爆发动作电位。（2）生理浓度的NGF能显著抑制SCG神经元M/KCNQ电流，其抑制M/KCNQ电流的机制可能是通过激活Trk A受体及其下游酪氨酸蛋白激酶磷酸化和PLC水解PI（4，5）P2两条信号通路。在三种神经元上，NGF抑制M/KCNQ电流的效应相似，但NGF只增强Tonic神经元的兴奋性，而对两种Phasic神经元兴奋性无影响。这可能与Phasic神经元M/KCNQ电流被NGF抑制后仍余留较大的电流能稳定其膜电位有关。（3）与NGF抑制M/KCNQ电流相同效应的低剂量Linopirdine能完全重现NGF对三种神经元兴奋性的效应。进一步提示NGF抑制Phasic神经元M/KCNQ电流后余留较大电流能稳定其膜电位。（4）M/KCNQ通道在癫痫、惊厥以及老年性痴呆等疾病发病中起重要作用，本研究证明NGF是M/KCNQ通道的一种新的调节因素，丰富了NGF的生物学功能，同时也为M/KCNQ通道的功能调节提供了新的思路。
　　 二、Genistein通过酪氨酸蛋白激酶依赖性和非依赖性两个信号通路抑制SCG神经元的电压门控性钠电流。
　　 目的：在大鼠SCG神经元记录电压门控性Na通道电流（VGSC电流）和神经元动作电位，观察Genistein对VGSC电流的调节作用，研究其调节机制。Genistein是广泛应用的非特异性酪氨酸蛋白激酶抑制剂，可广泛抑制细胞内酪氨酸蛋白激酶（或带有酪氨酸蛋白激酶活性的蛋白质）的活性。
　　 结论：（1）Genistein通过酪氨酸蛋白激酶依赖性和酪氨酸蛋白激酶非依赖性两种机制抑制SCG神经元的VGSC电流。（2）Genistein抑制SCG神经元的VGSC电流导致其降低神经元兴奋性和动作电位除极速率。
　　 三、 Gq蛋白偶联受体激活诱导的DRG神经元细胞内钙变化
　　 目的：研究同为G（f）蛋白偶联受体（G（q）PCRs）激活后对DRG神经元细胞内钙信号影响的异同，建立进一步研究细胞内钙信号在膜受体调节DRG神经元离子通道功能中的作用的基础。
　　 结论：几种G蛋白偶联受体中，CCK受体、ET-1受体、Mrg D受体和组胺受体激活后能升高DRG神经元细胞内钙。而SP受体、ATⅡ受体、5-HT受体和P2Y受体不能升高DRG神经元细胞内钙。
　　 四、辣椒素和CCK对DRG神经元TRPV1电流的调节。
　　 目的：文献报道和本实验室前期工作表明BK可引发TRPV1电流和Ca2+激活的氯电流。二者均为内向电流，可使膜电位除极化而爆发动作电位。本部分实验拟观察研究内容三中所涉及GPCRs激活可否引发DRG神经元内向电流以及电流成分和激活机制，同时研究GPCRs激活对TRPV1通道的功能调节。
　　 结果：（1）辣椒素（capsaicin，CAP，1μM）激活CAP阳性神经元TRPV1电流并很快脱敏。CAP激活的内向电流可被TRPV1通道特异性阻断剂capsazepine（CZP，100μM）迅速完全抑制，证明CAP引发的内向电流就是TRPV1电流。给予CAP20-30秒后，TRPV1电流激活达最大值，持续时间短，约10秒钟，然后很快发生脱敏现象。给予CAP5分钟末的TRPV1电流远小于给药20-30秒时的TRPV1最大电流，二者的比例为30.5％±3.6％。第一次给予1μM CAP30秒，此时TRPV1电流达最大值，冲洗5分钟，然后第二次给与1μM CAP30秒，第二次给药引发的TRPV1电流显著小于第一次给药引发的TRPV1电流，二者比例为50.7％±3.8％。（2）CCK-8在DRG神经元能引发微小的内向电流并能阻断CAP引起的TRPV1电流的脱敏现象。灌流给予1μM的CCK-8，在CAP阳性神经元或者CAP阴性神经元均能激活微弱的内向电流。用CCK预处理DRG神经元1 min，然后在CCK存在情况下给予1μM CAP5分钟，CCK可明显减弱TRPV1电流的快速衰减，只发生微小衰减，5分钟末的TRPV1电流（在CCK-8存在的情况下）占起始处TRPV1最大电流的68.4％±3.4％，与对照情况下相比，有显著的统计学差异。在第二次给予CAP之前，预先给予1μM的CCK-8处理细胞1分钟，第二次给予CAP所引发的TRPV1电流幅度与第一次CAP所引发的TRPV1电流幅度相似，而二者比例为91.2％±7.4％，与对照情况下相比，有显著的统计学差异。（3）其他受体激活后能否引发内向电流，还在实验中。
　　 总结
　　 1.从电生理角度看，大鼠颈上交感神经节（SCG）神经元根据神经元所表达的M/KCNQ电流的大小可分为Phasic-1、Phasic-2和Tonic三种神经元。Phasic-1和Phasic-2神经元表达M/KCNQ电流密度大，稳定膜电位作用较强，故其兴奋性较低，不易爆发动作电位；Tonic神经元表达M/KCNQ电流密度小，稳定膜电位作用较弱，故其兴奋性较高，较易爆发动作电位。
　　 2.生理浓度NGF显著抑制SCG神经元M/KCNQ电流，可能是通过激活TrkA受体及其下游酪氨酸蛋白激酶磷酸化和PLC-PI（4，5）P2水解两条信号通路。在三种神经元上，NGF抑制M/KCNQ电流的效应相似，但NGF只增强Tonic神经元的兴奋性，而对两种Phasic神经元兴奋性无影响。这可能与Phasic神经元M/KCNQ电流被NGF抑制后仍余留较大的电流能稳定其膜电位有关。与NGF抑制M/KCNQ电流相同效应的低剂量Linopirdine能完全重现NGF对三种神经元兴奋性的效应。进一步提示NGF抑制Phasic神经元M/KCNQ电流后余留较大电流能稳定其膜电位。
　　 3.Genistein通过酪氨酸蛋白激酶依赖性和酪氨酸蛋白激酶非依赖性两种机制抑制SCG神经元的电压依赖性钠通道（VGSC）电流。Genistein抑制SCG神经元的VGSC电流导致神经元兴奋性降低，动作电位除极速率减慢。
　　 4.几种G蛋白偶联受体中，BK受体、缩胆囊素受体（CCK）、内皮素受体、Mrg D受体和组胺受体能升高背根神经节（DRG）～元细胞内钙，而SP受体、血管紧张素Ⅱ受体、5羟色胺受体和ATP受体不能升高DRG神经元细胞内钙。
　　 5.辣椒素（CAP）激活TRPV1电流，并很快发生脱敏现象。CCK能在DRG神经元引发轻微的内向电流，同时能抑制CAP引起的TRPV1通道的脱敏现象。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写

声明

引言

Part one NGF inhibits M/KCNQ currents and selectively alters neuronal excitability in subsets of sympathetic neurons depending of their M/KCNQ current background

Introduction

Material and Methods

Results

Figures

Discussion

Summary

References

Part two Genistein inhibits voltage-gated sodium currents in SCG neurons through protein tyrosine kinase-dependent and-independent mechanisms

Introduction

Materials and Methods

Results

Figures

Discussion

Summary

References

第三部分 Gq蛋白偶联受体激活诱导的DRG神经元细胞内钙变化

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第四部分 辣椒素和CCK对DRG神经元TRPV1电流的调节

前言

材料和方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述 TRPV1通道功能调节的研究进展

致谢

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