CCK-8调节树突状细胞及其对胶原诱导型关节炎小鼠发病的影响

摘要

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以慢性侵蚀性周围关节炎为主要表现的自身免疫病。虽然其确切发病机制尚不完全清楚，但多数学者认为RA是在遗传和环境因素作用下由T淋巴细胞介导的自身免疫病，CD4+T细胞的分化异常和功能紊乱是其发病的重要原因。传统认为RA是Th1细胞占优势的疾病。然而，清除或中和Th1型细胞因子IFN-γ或IL-12，不能预防或减轻疾病进程。随后的研究发现IL-17在RA发病中有重要作用，IL-17可刺激单核细胞、巨噬细胞和滑膜细胞产生促炎细胞因子促进炎症反应，软骨破坏及血管翳形成。动物实验证实缺失分泌IL-17的T细胞可以使RA的发病受到抑制。因此，目前众多学者认为Th17细胞及其产生的IL-17是类风湿性关节炎发病的关键因素，抑制Th17细胞反应可能有利于RA病情缓解。
　　 基于上述理论和研究结果，我们推测CCK-8有可能通过调节DC表型和细胞因子分泌来调控CD4+T细胞的活化与分化，并进一步对RA的发病和转归产生影响。据此，本课题在体外细胞实验和疾病实验动物模型整体水平系统分析了CCK-8对DC功能的影响及其对CD4+T细胞活化与分化的调节作用，并进一步观察了CCK-8对RA实验动物模型-胶原诱导型小鼠关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）发病和关节病变的影响。1CCK-8体外作用DC对抗原特异性T细胞分化的影响
　　 第一部分:
　　 目的：DC活化过程中表达的协同刺激分子水平和分泌的细胞因子类型影响T细胞的活化和分化方向。调节DC成熟过程中的表面分子表达和细胞因子分泌将会对T细胞介导的免疫反应产生不同的影响。本部分研究主要采用体外细胞实验观察CCK-8对LPS诱导DC成熟过程中细胞表型和功能的影响，及其对抗原特异性CD4+T细胞增殖和分化的调节作用。
　　 方法：骨髓细胞自DBA/1J小鼠股骨和胫骨骨髓中分离，在含有GM-CSF的完全培养基中培养6～7天，收集悬浮和疏松贴壁细胞，作为骨髓来源的DC（bone marrow-derived dendritic cell，BM-DC）使用。（1）将BM-DC分为五组：Medium组（只加培养基）：LPS组（1μg/ml）；LPS（1μg/ml）+CCK-8（10-6、10-8、10-10mol/L）。将细胞按上述条件培养24h，收集细胞，分别同时加入PE-抗CD11c抗体和FITC-抗CD80、FITC-抗CD86或FITC-抗MHCII抗体，孵育30min，采用流式细胞仪进行检测。分析CD11c+细胞表面CD80、CD86和MHCII表达量的变化。（2）用CD11c+免疫磁珠分选BM-DC获得纯化的DC（purifled BM-DC，pBM-DC），将pBM-DC分为五组：Medium组（只加培养基）；LPS组（1μg/ml）；LPS（1μg/ml）+CCK-8（10-6、10-8、10-10 mol/L）。将细胞按上述条件培养24h。①收集上清，ELISA法检测IL-23含量；②收集细胞，用50μg/ml丝裂霉素C（mitomycin-C，MMC）37℃孵育1h后，与免疫磁珠分选的CII特异性CD4+T细胞共培养，采用MTS法测定T细胞增殖，采用ELISA法检测培养上清中IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β含量。
　　 结果：（1）未经LPS诱导的未成熟BM-DC表达较低水平的CD80、CD86和MHCII，经LPS诱导的成熟BM-DC CD80、CD86和MHCII表达显著增高，一定浓度的CCK-8与LPS同时作用则显著抑制了BM-DC CD80、CD86和MHCII表达，提示CCK-8可抑制LPS诱导BM-DC表型成熟。（2）未成熟pBM-DC分泌IL-23的能力非常低，低于试剂盒检测的下限。经LPS诱导的成熟pBM-DC分泌IL-23的水平明显升高，10-6和10-8mol/L CCK-8处理则显著抑制LPS诱导的IL-23分泌（P<0.05），10-10mol/L CCK-8处理作用效果不明显。（3）LPS诱导的成熟pBM-DC作为APC能显著刺激抗原特异性CD4+T细胞增殖，不同浓度CCK-8与LPS同时作用pBM-DC后则明显降低pBM-DC的刺激能力，CD4+T细胞的增殖活性下降（P<0.05）。（4）与未成熟pBM-DC相比，LPS诱导的成熟pBM-DC可刺激CD4+T细胞产生高水平IFN-γ和IL-17，一定浓度的CCK-8与LPS共同作用pBM-DC与LPS组相比显著提高IFN-γ的水平（P＜0.05），降低IL-17的产生（P<0.05），不同浓度CCK-8与LPS同时作用pBM-DC对CD4+T细胞产生IL-4和TGF-β的水平无明显影响（P>0.05）。
　　 第二部分：
　　 目的：第一部分体外细胞实验证实，CCK-8通过调节DC成熟过程中的细胞表型和细胞因子分泌对抗原特异性CD4+T细胞的增殖和分化发挥调节作用。本部分研究我们将在疾病实验动物模型整体水平观察CCK-8对DC和CD4+T细胞的调节作用。
　　 方法：采用鸡CII加弗氏完全佐剂的乳化液免疫RA易感动物DBA/1J小鼠，建立CIA模型。小鼠随机分为四组：生理盐水对照组；CCK-8 lnmol组；CCK-8 5nmol组；CCK-8 10nmol组。各组小鼠于第二次增强免疫同时，腹腔注射以上药物，每天注射1次，连续注射7天。于第一次免疫后28天，取各组小鼠腹股沟引流淋巴结：（1）采用流式细胞双标术检测CD11c+细胞表面CD80、CD86和MHCII表达。（2）提取总RNA，采用荧光定量RT-PCR法检测IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19、IL-6、T-bet（T-box expressed in T cells）、Gata-3（GATA binding protein 3）、RORγt（orphan nuclear receptor gammat）、Foxp3（foxhead/winged-helix box protein 3）、IFNγ、IL-4、IL-17和TGF-β mRNA表达。（3）免疫磁珠分选CD4+T细胞，经CII刺激，MTS法检测细胞增殖，ELISA法检测培养上清中IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β的含量。
　　 以上结果表明：CCK-8腹腔注射CIA小鼠能够下调DC表面CD80、CD86和MHCII表达，并通过抑制IL-6和IL-23的产生，促进IL-12的产生，抑制CD4+T细胞向Th17细胞分化，促进其向Thl和Treg细胞分化。3 CCK-8对CIA发病和关节病变的影响
　　 第三部分：
　　 目的：目前研究表明Th17细胞通过分泌IL-17在RA发病中发挥关键作用。本课题前两部分体内外实验证实，CCK-8通过调节DC细胞表型和细胞因子分泌对抗原特异性CD4+T细胞的活化和分化发挥调节作用，尤其是抑制抗原特异性Th17细胞反应，提示CCK-8可能会延缓或防止RA发病。因此，本部分实验我们建立CIA模型，观察CCK-8对RA发病的影响。
　　 方法：CIA模型的建立及分组处理同第二部分。于第二次增强免疫同时，隔日对小鼠发病率及关节肿胀程度进行观测。于第一次免疫后35天，（1）取小鼠后肢踝关节观察组织病理改变；（2）取小鼠后肢踝关节提取组织蛋白，检测各种炎性细胞因子和调节因子水平：（3）留取小鼠血清检测抗CII特异性抗体及其亚型水平。
　　 结果：结果表明：CCK-8能有效抑制CIA发病，降低发病率、推迟发病时间、降低关节病理损伤程度。CCK-8发挥作用的机制主要与其抑制抗原特异性Th17细胞介导的自身免疫反应和炎症反应有关。
　　 结论：本研究系统分析了CCK-8体内外作用对DC功能的影响及其对抗原特异性CD4+T细胞活化和分化的调节作用，在此基础上观察了CCK-8对CIA发病和关节病变的影响。得出以下结论：
　　 1、CCK-8体外作用通过调节DC成熟过程中的细胞表型和细胞因子分泌对抗原特异性CD4+T细胞的增殖和分化发挥调节作用。通过上调IL-12的产生促进Th1细胞分化，下调IL-6和IL-23的产生抑制Th17细胞分化和扩增。
　　 2、CCK-8体内作用CIA小鼠同样能够下调DC表面CD80、CD86和MHCII的表达，抑制IL-6和IL-23 p19 mRNA表达，促进IL-12 p35和p40mRNA表达，抑制CD4+T细胞向Th17细胞分化，促进其向Thl和Treg细胞分化。
　　 3、CCK-8能有效抑制CIA发病，降低发病率、推迟发病时间、降低关节病理损伤程度。
　　 总之，CCK-8腹腔注射CIA小鼠可有效抑制发病，降低发病率、减轻关节病理损伤。CCK-8可通过多靶点发挥作用，其中最主要的途径是通过调节DC细胞表型和细胞因子分泌抑制抗原特异性Th17细胞介导的自身免疫反应和炎症反应。本研究为合理评价CCK-8对RA治疗的潜在价值提供了重要的动物实验和理论依据。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写

引言

第一部分 CCK-8体外作用DC对抗原特异性T细胞分化的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 CCK-8体内作用对DC功能及T细胞分化的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 CCK-8对胶原诱导型小鼠关节炎发病和关节病变的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述 T细胞与类风湿性关节炎

参考文献

致谢

个人简历