人工发酵虫草菌丝体干粉和罗格列酮对糖尿病大鼠肺组织AGEs、NF-κB和NADPH氧化酶表达的影响

摘要

目的:糖尿病肺损害(diabetic lung damage)已经被证实是糖尿病(diabetes mellitus,DM)的慢性并发症之一。其发病机制尚未明确。糖尿病引起的氧化应激是导致糖尿病并发症发生的根本原因。国内外研究表明氧化应激参与了糖尿病肺损伤的过程,并起重要作用。晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)与DM多种慢性并发症的发生、发展有密切关系。AGEs与细胞表面的晚期糖基化产物受体(RAGE)结合后可引起活性氧(reactlve oxygen species,ROS)大量生成,导致氧化应激。在正常生理和病理条件下,体内有多种酶参与了ROS的生成,目前研究表明,主要存在于非吞噬细胞的NADPH氧化酶是机体ROS的主要来源。在受到特异因素,如细胞因子、高血糖、AGEs、氧化脂等刺激后,NADPH氧化酶活化,发生氧化爆发,引起大量的ROS生成,导致组织损伤。NF-κB是一种广泛存在于各种细胞,具有多种调节作用的转录因子。在静息状态下,NF-κB与IκB以非活性形式存在于胞质中,当细胞遇到各种刺激原如氧自由基、细胞因子、病毒等作用时,IκB发生快速降解,NF-κB与IκB解离并进入胞核,并与特定的κB序列结合,从而调控相应基因的表达。冬虫夏草Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc.入肺、肾经,有补肺肾、益虚损、扶精气之功效,其中含有的微量元素可作为谷胱甘肽过氧化物酶等酶的辅酶,提高其活性,具有抗氧化作用。罗格列酮(rosiglitazone,RSG)属于噻唑烷二酮类药物(TZDs),是核转录因子PPAR7强有效的激动剂,具有调节糖脂代谢,降压,抗炎,抗增殖及抗氧化作用。本研究通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ),建立1型糖尿病大鼠模型,并应用人工发酵虫草菌丝体干粉和罗格列酮钠进行干预,通过免疫组织化学、RT-PCR等方法检测实验动物肺脏组织中AGEs、NF-κB和NADPH氧化酶的表达变化,探讨AGEs、NF-κB和NADPH氧化酶在糖尿病肺损害的病理作用以及虫草粉和RSG在其中发挥的保护作用。
　　 方法:
　　 8周龄SD大鼠60只分为正常对照组和实验组,随机抽取15只大鼠作为正常对照组(A组),剩余的45只大鼠作为实验组。实验组大鼠腹腔一次性注射大剂量(55mg/kg)链脲佐菌素,72h小时后取尾静脉血BG测定大于16.7mmol/L,持续3天,确认为1型糖尿病造模成功。将成模大鼠随机分为糖尿病对照组(B组)、人工发酵虫草菌丝体干粉(2.4g/kg/d)干预组(C组)和罗格列酮(4mg/kg/d)干预组(D组)。实验的药物干预持续12周。在造模前及成模后0、4、8、12周末测定大鼠血糖、体重和尿量;于第12周末股动脉放血处死动物,取出糖尿病大鼠双侧肺脏,右侧肺组织用于制备光镜切片,运用HE染色方法观察肺组织形态学变化,应用免疫组织化学方法检测肺组织中AGEs、NF-κB的蛋白表达部位及表达水平;左侧肺组织应用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测肺组织NF-κB和NADPH氧化酶的重要亚基p22phox mRNA的表达水平。使用SPSS13.0统计软件处理实验数据。各组的数据先进行正态性和方差齐性检验,符合正态且方差齐性的数据,多组比较采用方差分析,组间比较采用LSD检验。
　　 结果:
　　 1：实验第4周、8周和12周末时,B、C和D组BG水平均明显高于A组,且体重较A组降低,差异均具有统计学意义(均P＜0.01)。B、C、D组三组之间的血糖和体重无统计学差异(均P＞0.05)。
　　 2：HE染色结果显示,与A组比较,B组DM大鼠肺泡结构破坏,肺泡腔缩小,严重者出现萎缩塌陷,肺泡隔增厚,大量炎细胞浸润。肺泡毛细血管出现狭窄,甚至闭塞。C、D组较B组有所改善。
　　 3：免疫组织化学分析结果示,与A组比较,B组AGEs、NF-κB表达明显增强,胞核及胞浆可见较多的棕黄色颗粒,气管粘膜上皮、肺泡上皮细胞及肺间质均有较强表达,具有统计学差异(P均＜0.01);与B组比较,C组和D组的表达较B组有明显改善,差异具有统计学意义(P均＜0.01)。
　　 4：RT-PCR结果显示,B组、C组和D组大鼠肺组织NF-κB mRNA,p22phoxmRNA的表达较A组升高(P均＜0.01);C组和D组大鼠肺组织中NF-κBmRNA,p22phox mRNA表达较B组降低且差异具有统计学意义(P均＜0.01),C组和D组之间进行比较无统计学差异(P＞0.05)。
　　 结论:
　　 1：一次性腹腔注射大剂量STZ,破坏大鼠胰岛β细胞,建立持续血糖升高、体重减轻、尿量增加为特征的1型糖尿病大鼠模型。此模型与人类1型糖尿病特征类似。
　　 2：糖尿病大鼠肺组织存在病理形态学改变,提示肺脏是糖尿病损害的靶器官之一。糖尿病组大鼠肺组织AGEs、NF-κB和p22phox表达水平明显高于正常对照组,并且三者可能存在一定的相互作用,提示三者表达水平的改变与糖尿病肺损害的发生发展密切相关。
　　 3：经人工发酵虫草菌丝体干粉和罗格列酮干预后,肺组织AGEs、NF-κB和p22phox表达下降,肺组织的病理形态明显改善,提示两种药物干预可能是通过抗氧化应激和抑制炎症使相应的调控基因发生变化而发挥肺脏保护作用。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 糖尿病肺损害与氧化应激的研究现状

致谢

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