糖尿病大鼠肾组织NF-κB、MCP-1和FN的表达及人工发酵虫草菌丝体干粉和罗格列酮的干预作用

摘要

目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)主要的微血管并发症之一。糖尿病肾病的发病机制与多元醇代谢途径异常、糖基化终末产物形成、肾小球血流动力学改变、氧化应激及脂代谢紊乱有关。此外,越来越多的研究还发现低度的炎症在糖尿病肾病的进展中起到了重要的作用。核因子-kappa B(NF-kB)是一种广泛存在于各种细胞的核转录因子,它参与细胞内的信号传递,调控多种基因的表达,其激活可导致多种炎症介质的释放。单核细胞趋化蛋白.1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)是由活化的巨噬细胞及间充质细胞分泌的强效的趋化因子,其能趋化单核细胞和T淋巴细胞,诱导单核细胞、内皮细胞表达粘附分子,使各种炎性细胞尤其是单核细胞向病变部位聚集。在MCP-1的启动子及增强子序列均有NF-kB的结合位点,NF-kB是调控MCP-1基因表达的最重要的转录因子之一。纤维连接蛋白(fibronectin,FN)作为肾小球ECM的主要组成部分,其具有明显的结合纤维蛋白、纤维蛋白原及胶原的能力,FN的持续增加,促进了肾脏纤维化和硬化。冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.为麦角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体,传统医学认为其入肺、肾经,有补肺肾、益虚损、扶精气之功效。罗格列酮是噻唑烷二酮类药物,是有效的核转录因子PPARγ的选择性激动剂,其可以通过调节糖脂代谢、改善胰岛素抵抗、抗高血压、改善炎症和动脉粥样硬化等途径发挥肾脏保护作用。本研究通过一次性腹腔大量注射STZ的方法,建立1型糖尿病大鼠模型,并应用人工发酵虫草菌丝体干粉(金水宝)和罗格列酮钠(太罗)进行干预,通过病理形态学、分子生物学等方法检测实验动物肾脏组织中NF-kB、MCP-1及FN的蛋白表达,来探讨NF-kB、MCP-1及FN在糖尿病。肾脏病变发生发展中的作用以人工发酵虫草菌丝体干粉和罗格列酮的肾脏保护作用机制。
　　 方法:从60只雄性8周龄SD大鼠中随机抽取15只作为正常对照组(A组),其余作为实验组。实验组大鼠给予腹腔一次性注射大剂量(55mg/kg)链脲佐菌素。72h小时后,尾静脉采血测定BG大于16.7mmol/L,持续3天,作为造模成功的标准。把成模大鼠随机分为糖尿病对照组(B组)、糖尿病人工发酵虫草菌丝体干粉(2.4g/kg/d)干预组(C组)、糖尿病罗格列酮(4mg/kg/d)干预组(D组)。药物干预共持续12周。分别于造模前及成模后0、4、8、12周末测定大鼠血糖和体重；实验结束前,用代谢笼收集24小时尿液,放射免疫分析法测定24小时尿白蛋白排泄量(UAE)；于第12周末,测定血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、谷丙转氨酶(ALT)水平；取出大鼠双肾,除去包膜,分别进行病理学HE染色和PAS染色观察肾脏形态学变化,免疫组化的方法检测肾脏NF-kB、MCP-1和FN的蛋白表达情况和表达部位,Western印迹方法检测肾脏NF-kB的蛋白表达水平。使用SPSS13.0统计软件处理实验结果。各组数据比较前先进行方差齐性检验,符合方差齐性的数据多组比较采用方差分析(ANOVA),组间比较采用LSD检验。等级资料采用Kruskal-Wallis H检验,组间比较采用Nemenyi检验。
　　 结果:
　　 1实验第4周、8周和12周末时,B、C和D组体重较A组明显降低(均P<0.01),BG水平均高于A组(均P<0.01)。B、C、D组三组之间比较体重和血糖无显著性差异(均P>0.05)。
　　 2实验第12周末,B组大鼠与A组比较,肾脏肥大指数明显升高(P<0.01),C、D组与B组比较肾脏肥大指数明显降低(均P<0.01)。
　　 3实验12周末大鼠的各项生化指标:B组大鼠BUN、Scr、UAE水平均明显高于A组(均P<0.01),C组BUN、Scr、UAE水平均较B组显著下降(P<0.01,P<0.05,P<0.01),D组BUN、Scr、UAE水平均较B组显著下降(均P<0.01)。B组大鼠TC水平明显高于A组(P<0.01),C组TC水平较B组明显降低(P<0.01),D组与B组之间无明显差异(P>0.05)。B组大鼠TG水平明显高于A组(P<0.01),C、D组TG水平明显低于B组(均P<0.01)。B、C、D三组大鼠ALT水平明显高于A组(均P<0.01),且B、C、D三组之间无明显差异(均P>0.05)。
　　 4 HE染色:B组大鼠肾小球面积增大,系膜基质显著增生,肾小球基底膜及囊壁增厚。肾小管出现细胞空泡样变性,管腔变窄。C、D组肾小球病变均明显轻于B组。
　　 5 PAS染色:B组肾小球系膜区细胞外基质明显增生,PAS染色呈强阳性。C、D组均较B组有改善。
　　 6免疫组织化学染色:A组的肾脏NF-kB、MCP-1、FN阳性表达不显著,B组的NF-kB、MCP-1、FN阳性表达较A组明显增强(均P<0.01),肾小球基底膜、肾小管和肾间质均有强表达,C、D组的阳性表达较B组有不同程度减弱(均P<0.05)。
　　 7 Western印迹:B组的肾脏NF-kB蛋白的表达较A组明显升高(P<0.01),C、D组NF-kB蛋白的表达较B组降低且差异具有显著性(均P<0.01)。
　　 结论:
　　 1应用一次性腹腔大剂量注射STZ方法,破坏大鼠胰岛β细胞,造成胰岛素分泌绝对不足,可以复制出类似于临床1型糖尿病发病特点的大鼠模型。
　　 2糖尿病大鼠NF-kB、MCP-1、FN蛋白表达水平明显高于正常对照组,提示由NF-kB高表达介导,MCP-1及FN参与的炎症反应与DN的发生发展密切相关。
　　 3人工发酵虫草菌丝体干粉和罗格列酮可能通过抑制由NF-kB高表达介导的炎症反应,减少肾脏单核巨噬细胞的浸润和纤维连接蛋白的沉积来发挥肾脏保护作用的,且其肾脏保护作用独立于降糖作用之外。

目录

文摘

英文文摘

研究论文 糖尿病大鼠肾组织NF-κB、MCP-1和FN的表达及人工发酵虫草菌丝体干粉和罗格列酮的干预作用

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

结论

参考文献

综述NF-κB与糖尿病肾病的研究进展

参考文献

致谢

个人简历