兔角膜穿通伤愈合过程中应用重组人干扰素α-1b滴眼液对角膜瘢痕形成的影响的研究

摘要

目的：角膜是位于眼球最前部的组织，具有高度的透明性，是眼球的主要屈光介质，对整个眼球的屈光发挥着重要作用。此外，角膜有其独特的生理和物理学特性对眼内容物起着保护作用。角膜的透明性主要取决于角膜基质中胶原纤维、蛋白多糖和角膜细胞三者的正常结构，任何形式的角膜创伤修复都会造成三者的结构改变，从而对角膜的透明性造成影响。因此，研究角膜穿通伤愈合过程中伤口的纤维化作用具有重要的意义。
　　在角膜穿通伤愈合过程中，实质层外伤或缺损时，角膜的基质细胞(corneal stroma cells，CSCs)转化为成纤维细胞或肌成纤维细胞，促进角膜伤口的愈合，同时细胞的特性也会随之发生转变，细胞相应变为不透明状，从而形成角膜瘢痕。在此之后，炎症反应随之下降，创口进入了重建阶段，纤维组织逐渐被填满缺损，新的胶原纤维排列相当很不规则，在临床上留下不同程度的瘢痕及角膜散光，若瘢痕波及瞳孔区则会严重影响视力。在角膜愈合过程中，角膜基质细胞减少，其表达的角膜蛋白(keratocan)相应减少。成纤维细胞特异表达的CD90在转化为肌成纤维细胞的过程中减少。肌成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)相应增多。
　　角膜穿通伤后，承受外力的水平会下降。在愈合过程中，承受外力的水平会逐渐增强，直至达到正常水平。
　　抗纤维化的药物有很多种，临床上主要有糖皮质激素、抗代谢药物和干扰素，但糖皮质激素和抗代谢药物有较多的副作用。干扰素是一种免疫应答过程中自然形成的多肽，最初仅发现它有干扰病毒复制和抑制病毒繁殖的作用，故一直用于抗病毒治疗。此后，其抑制细胞分泌、免疫调节、抗肿瘤及抗纤维化等一系列生物活性逐渐得到了证实。国外学者报道干扰素能抑制成纤维细胞的分化、增殖及胶原化。
　　本实验通过制备兔角膜穿通伤模型，观察应用干扰素后不同时间点的：1、角膜拉力的变化。2、通过PCR分析α-SMA、keratocan、CD90的表达情况。旨在观察应用重组人干扰素a－1b滴眼液对兔角膜穿通伤缝合术后不同时间点的角膜愈合及瘢痕形成情况的影响，试图寻找在增强角膜韧性的同时可以减少瘢痕形成的有效药物。
　　方法：
　　1制作兔角膜中央穿通伤模型，用30 g/L戊巴比妥行耳缘静脉(1 ml/kg)注射，行全身麻醉后，将动物固定于兔台上，自角膜由6点至12点用规尺准确测量长5mm角膜正中距离，用15°前房穿刺刀垂直角膜快速穿透，用10-0非吸收缝线等间距对位间断缝合角膜伤口3针。术后每只动物左眼为实验眼、右眼为对照眼，根据重组人干扰素α-1b滴眼液说明书，实验眼点用重组人干扰素α-1b滴眼液每日4次及氯霉素滴眼液每日4次，对照组点用氯霉素滴眼液每日4次。
　　2分别于术后1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周取完整角膜，将包含整个角膜伤口的10mm×5mm角膜试件夹在专门夹具上，在BOSE electroforce3220-AT生物力学试验机上进行拉伸破坏实验。拉力破坏试验中试件以0.06mm/sec的载荷加载，以0.02Hz的频率采集数据和图形，单轴拉伸直至试件断裂。
　　3分别于术后1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周取完整角膜，采用RT-PCR方法检测各时间点中角膜内keratocan、CD90、α-SMA基因的表达情况。
　　4应用SPSS13.0软件进行统计学分析。
　　结果：
　　1角膜拉力
　　对照组角膜拉力持续升高，到第6周趋于稳定，前6周拉力数值任意两个时间点间比较均有统计学差异(P<0.01)，第6周至第9周拉力数值任意两个时间点间比较无统计学差异(P>0.05)。实验组角膜拉力持续升高，但同一时间点数值较对照组低，到第8周趋于稳定，前8周拉力数值任意两个时间点间比较均有统计学差异(P<0.01)，第8周后增长缓慢，第8周与第9周间拉力数值比较无统计学差异(P>0.05)。
　　实验组第8周的拉力数值与对照组第6周的拉力数值相近，t检验比较无统计学差异(t=2.757；P=0.051；P>0.05)。
　　2 RT-PCR
　　对照组角膜基质细胞标记物keratocan随着时间的增长其表达逐渐下降，第6周后趋于稳定，前6周任意两个时间点间表达的比较均有统计学差异(P<0.01)，第6周至第9周任意两个时间点间表达的比较无统计学差异(P>0.05)。实验组前3周表达逐渐下降，前3周任意两个时间点间表达的比较均有统计学差异(P<0.05)；第3周后逐渐上升，第3周至第8周任意两个时间点间表达的比较均有统计学差异(P<0.05)；到第8周升高趋于稳定，第8周与第9周间表达的比较无统计学差异(P>0.05)。
　　对照组CD90、α-SMA的表达随着时间的延长逐渐增强，到第6周趋于稳定，前6周任意两个时间点间表达的比较均有统计学差异(P<0.01)，第6周后增长缓慢，第6周与第9周任意两个时间点间表达的比较无统计学差异(P>0.05)。实验组CD90、α-SMA的表达随着时间的延长持续升高，但同一时间点数值较对照组低，到第8周趋于稳定，前8周任意两个时间点间表达的比较均有统计学差异(P<0.05)，第8周后增长缓慢，第8周与第9周间表达的比较无统计学差异(P>0.05)。
　　α-SMA实验组第8周的表达与对照组第6周的表达数值相近，t检验比较无统计学差异(t=2.754；P=0.051；P>0.05)。
　　CD90实验组第8周的表达低于对照组第6周的表达，t检验比较有统计学差异(t=14.085；P=0.000；P<0.01)。
　　结论：
　　1兔角膜穿通伤缝合术后应用干扰素抑制角膜细胞转化为成纤维细胞从而减轻角膜瘢痕的形成。
　　2兔角膜穿通伤缝合术后应用干扰素虽在早期抑制成纤维细胞转化为肌成纤维细胞但最终肌成纤维细胞并不减少从而不影响角膜的承载能力。
　　3兔角膜穿通伤缝合术后应用干扰素可在不影响角膜韧性的情况下减少瘢痕形成。