17-AAG联合顺铂治疗BALB/c小鼠肝癌腹腔转移的实验研究

摘要

目的：应用HE染色、扫描电镜技术、透射电镜技术观察顺铂联合17-AAG腹腔化疗后对小鼠膈肌的影响，评价其抗肿瘤效果，以期为肿瘤治疗提供生物学资料。
　　方法：选取BALB/c小鼠50只，SPF级，体重(20～21)g，标准颗粒饲料喂养，自由采食和饮水。将小鼠随机分为5组，分别为：①空白对照组；②肿瘤模型组；③顺铂治疗组；④17-AAG治疗组；⑤17-AAG与顺铂联合治疗组。每组10只。空白对照组不予处理，其余四组腹腔注入H22肿瘤细胞造成肿瘤模型。5组小鼠分别给予不同的干预。10天后处死全部小鼠。1.观察小鼠一般情况，测量小鼠的体重变化。2.BALB/c小鼠用4％多聚甲醛灌流固定后，取下整块膈肌。HE染色观察各组小鼠膈肌的变化。3.用Karnovesky灌流液固定后，取下整块膈肌，以2 N NaoH室温消化2小时、2 N NaoH室温消化6天以及取材后直接观察三种不同处理方法处理后，经常规脱水、干燥、镀膜后，用扫描电镜观察各组小鼠膈肌上皮及上皮下结缔组织结构的变化。4.用Karnovesky灌流液固定后，在小鼠膈肌的肌性部取下1mm3大小的组织块，用透射电镜观察其超微结构的改变。
　　结果：
　　1.小鼠一般情况：造模前，各组小鼠皮毛光泽，精神状态好，各组小鼠体重均在(20～21)g。造模第10天，肿瘤模型组小鼠腹水较空白对照组增多显著，体重显著增加(P<0.05)，整个腹部膨胀突出呈球形，小鼠疲乏无力，自主活动减少，皮毛稀疏、失去光泽；顺铂治疗组，生长状态良好，毛发正常，体重较肿瘤模型组有显著差异(P<0.05)，而较空白对照组无显著性差异(P>0.05)；17-AAG治疗组小鼠体重较空白对照组明显增加(P<0.05)，与肿瘤模型组体重无明显差异(P>0.05)；17-AAG与顺铂联合用药组小鼠状态、体重介于顺铂治疗组与17-AAG治疗组之间。与肿瘤模型组以及17AAG治疗组小鼠体重有明显差异(P<0.05)，与空白对照组、顺铂治疗组小鼠体重也有明显差异(P<0.05)。
　　2.HE染色结果：空白对照组腹膜间皮细胞呈扁平状，排列紧密，紧贴其下的结缔组织，上皮下结缔组织不明显。间皮细胞呈扁平状，排列紧密，细胞核呈扁椭圆形，位于细胞中央。模型组的部分腹膜间皮细胞增高，变圆，呈立方形，细胞核增大，变圆。同时可以看到上皮表面有肿瘤细胞粘附，上皮下结缔组织增生，血管、淋巴管数量增多，管腔扩张，部分肿瘤细胞通过上皮细胞之间的间隙进入结缔组织形成肿瘤细胞浸润或进入管腔，部分肿瘤细胞穿过管腔后浸润到肌细胞表面。17-AAG组与模型组大致相似，无明显差别。顺铂组腹膜间皮细胞呈扁平状，排列紧密，细胞核呈扁椭圆形，位于细胞中央，上皮下有少量结缔组织增生，但未见肿瘤细胞浸润。顺铂与17-AAG联用组可见腹膜间皮细胞部分细胞增高，变圆，呈立方形，细胞核增大，变圆细胞排列较规则，细胞间隙较正常组增大。上皮表面有肿瘤细胞粘附，上皮下结缔组织增生，可见少量肿瘤细胞通过上皮细胞间隙进入结缔组织或管腔，肌层未见肿瘤细胞浸润。
　　3.扫描电镜结果：扫描电镜观察可见空白对照组膈肌上皮细胞由一单层间皮细胞排列而成，包括两种所处部位和构造不同的腹膜间皮细胞，一种为扁平形细胞，表面有短小的微绒毛存在，相邻细胞呈锯齿状连接，其间无腹膜孔分布；另一种是立方形小细胞，细胞表面微绒毛短小而稀疏，其间有散在或呈簇状分布的腹膜孔。两种细胞呈条带状交替性分布。模型组的部分区域膈肌上皮细胞表面覆盖一层肿瘤细胞。膈肌上皮细胞中的立方形小细胞形态、排列不规则，表面微绒毛显著增多，呈毛刷状布满细胞表面，上皮细胞之间的间隙被肿瘤细胞填满，未见腹膜孔。顺铂组两种呈条带状交替性分布的膈肌表皮细胞排列较规则，其中立方形小细胞表面微绒毛显著增多，呈毛刷状布满细胞表面；扁平细胞表面微绒毛减少，相邻细胞连接紧密，细胞边界不清楚。17-AAG组可见腹膜间皮细胞之间分布着大量肿瘤细胞，细胞排列紧密，肿瘤细胞将上皮细胞之间的间隙填满，未见腹膜孔分布。17-AAG与顺铂联用组膈肌上皮细胞的扁平细胞的微绒毛减少或缺失，细胞之间的界限不清；立方形细胞表面微绒毛与空白对照组相似，其间未见腹膜孔。经2N NaoH溶液中于室温消化6天后观察，小鼠的上皮细胞被消化掉，仅剩上皮下结缔组织，各组小鼠上皮下纤维结缔组织无明显差异，可见许多筛斑，筛斑呈卵形、梭形或多角形，主要分布于膈的肌性部位的腹膜间皮下。
　　4.透射电镜结果：正常组小鼠膈肌腹膜间皮细胞呈扁平状，形态规则，排列紧密，细胞核呈扁椭圆形，位于细胞中央。模型组小鼠膈肌部分腹膜间皮细胞，增高，变圆，呈立方形，细胞之间的间隙增大，上皮下结缔组织大量增生，大量肿瘤细胞穿过上皮层进入结缔组织或管腔。顺铂组小鼠膈肌腹膜间皮细胞呈扁平状，排列紧密，细胞核呈扁椭圆形，位于细胞中央，但是上皮下结缔组织增生，出现大的管状结构，但未见肿瘤细胞穿入。17-AAG组小鼠膈肌腹膜间皮细胞，增高，呈立方形，细胞之间的间隙增大，结缔组织增生，可见大管状结构存在，有肿瘤细胞浸润。17-AAG与顺铂联用组小鼠膈肌腹膜间皮部分细胞增高，上皮下结缔组织中管状结构增多，但未见肿瘤细胞进入管状结构。
　　结论：
　　1.腹腔大量癌性腹水的小鼠膈肌上皮细胞增高，变圆，呈立方形。上皮细胞的这种结构变化使细胞之间的间隙变大。上皮细胞之间有大量的肿瘤细胞分布。肿瘤细胞排列紧密，填满上皮细胞之间的空隙，看不到腹膜孔。说明大量的肿瘤细胞阻塞淋巴孔和筛孔。腹水的形成与淋巴回流受阻，腹腔液吸收障碍有关。
　　2.17-AAG与顺铂联合用药后，小鼠膈肌上皮的形态介于17-AAG治疗组与顺铂治疗组之间。