活血化瘀通络中药对糖尿病大鼠胃轻瘫的作用及对Cx43、SP和神经型一氧化氮合酶的影响

摘要

目的:糖尿病胃轻瘫(diabeticgastoparesis，DGP)是在糖尿病基础上出现腹胀、早饱、恶心、呕吐等胃肠症状，同时合并明显的胃排空延迟，上胃肠测压动力异常等。糖尿病胃动力障碍形成原因复杂，机制尚未完全阐明。既往对糖尿病胃轻瘫的发病机制研究多集中于神经病变、血糖水平、微血管病变、胃肠道平滑肌病变以及胃肠激素紊乱等，但这些因素尚不能完全解释其发病机制。而近年来以ICC为对象，对胃肠神经-ICC-平滑肌网络的研究尤其引人关注。胃肠神经-ICC-平滑肌网络形成一完整的功能体，作为胃肠动力的基本功能单位，在胃肠动力变化中起着重要的作用。在胃肠神经-ICC-平滑肌网络中有一些重要的因子，如:P物质(substanceP，SP)作为一种非胆碱能兴奋性神经递质，有增加胃肠蠕动，强烈促消化道平滑肌收缩的作用，对维持正常的胃肠运动功能有着重要作用;神经型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)通过神经传导及释放神经递质对消化道正常生理功能调控，相关消化道疾病病理联系方面，以及糖尿病胃排空延迟方面有重要作用;Cx43是胃肠平滑肌细胞之间最重要的间隙连接蛋白，在ICC向平滑肌电活动的传播中起重要作用，从而影响平滑肌的收缩活动，对糖尿病胃排空延迟、胃肠运动功能障碍方面有重要作用。
　　 目前，有关糖尿病胃轻瘫的治疗多采用在控制血糖的基础上，提倡患者少食多餐，选择易消化、低脂肪、少渣的食物，另外还常使用促胃肠动力药，如西沙比利、吗丁啉等，还有学者采用胃电起搏以及手术治疗等，但效果均不理想。国内临床报道中医药运用中医整体观和辨证论治的原则治疗糖尿病胃轻瘫不仅能治愈或改善胃轻瘫的症状，同时又能兼顾降血糖，起到双重治疗作用。中药丹参凉血养血活血，川芎行气活血，水蛭、地龙具有通络作用，在临床中应用丹参、川芎、水蛭、地龙活血化瘀通络复方治疗糖尿病胃轻瘫取得良好疗效，本研究通过腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)的方法建立大鼠糖尿病模型，应用活血化瘀通络中成药丹参、川芎、水蛭、地龙拆方及合方对该模型进行干预，通过观察实验动物的一般情况、血糖及体重、胃排空率的情况，观察胃的病理学形态，检测胃组织nNOS水平，胃组织Cx43、SP水平，探讨活血化瘀通络中药对糖尿病大鼠胃轻瘫的作用及可能机制，为临床治疗本病提供实验依据。
　　 方法:清洁级健康雄性(SpragueDawley)SD大鼠50只，体重250±20克，适应性饲养1周后按体重随机分为正常对照组(Normal)8只、模型组(Model)12只、中药丹参、川芎组ZY(A)10只、中药水蛭、地龙组ZY(B)10只、中药丹参、川芎与水蛭、地龙合方组ZY(C)10只。除正常对照组外，模型组、中药各组腹腔注射配制好的STZ(55mg/kg体重)，建立糖尿病大鼠模型，正常对照组腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液。确定造模成功后，中药(A)组给予丹参、川芎1.2g(kg.d)灌胃、中药(B)组给予水蛭、地龙1.2g(kg.d)灌胃、中药(C)组给予丹参、川芎与水蛭、地龙合方1.2g(kg.d)灌胃，正常对照组及模型组给予等体积的生理盐水灌胃，每日一次，共8周。于第8周末，各组大鼠称重，再禁食16-24小时、禁水2小时后，予大鼠500mg/L酚红溶液2ml灌胃，15分钟后按2ml/kg体重腹腔注射8％异戊巴比妥钠麻醉后，剖开腹腔，结扎贲门和幽门，取出整个鼠胃，沿胃大弯切开，以蒸馏水冲洗胃内容物，定容为20ml，用来检测胃排空率。留取部分胃组织，置于4％多聚甲醛固定液中，应用HE染色观察各组大鼠胃的病理形态学变化;免疫组织化学方法检测胃组织中Cx43及SP的表达。留取部分胃组织于液氮速冻后置于-80℃低温冰箱内保存，反转录聚合酶联反应(reversetranscription-polymerasechainreactionRT-PCR)法检测胃组织中nNOSmRNA的含量。
　　 结果:
　　 1大鼠一般状况比较
　　 正常对照组大鼠的体重明显增加，精神状态良好，毛皮光泽，动作自如、反应敏捷，摄食量、饮水量以及尿量正常，在整个实验期间无明显的变化;注射STZ成模的大鼠逐渐出现多食、多饮、多尿，活动明显减少，反应迟钝，毛色晦暗无光泽。
　　 2各组大鼠血糖及体重的比较
　　 各组大鼠体重结果显示:与正常对照组相比，模型组、中药各组大鼠体重明显低于正常组大鼠体重(P＜0.05）;与模型组相比，中药各组大鼠体重无显著差异;中药各组之间相比，体重也无显著差异。各组大鼠血糖结果显示:与正常对照组相比，模型组、中药各组大鼠血糖水平明显升高(P＜0.05);与模型组相比，中药各组大鼠血糖水平明显降低(P＜0.05);中药组间相比，中药ZY(C)组较中药ZY(A)、中药ZY(B)组血糖水平明显降低(P＜0.05）。
　　 3各组大鼠胃排空率的比较
　　 与正常对照组相比，模型组、中药各组大鼠胃排空率均有明显降低(P＜0.05);与模型组相比，中药各组大鼠胃排空率均有明显升高(P＜0.05);中药组间相比，中药ZY(C)组较中药ZY(A)、中药ZY(B)组胃排空率有明显升高（P＜0.05）。
　　 4HE染色结果
　　 正常对照组大鼠胃粘膜完整，粘膜层次结构清楚，腺体排列整齐，血管丰富，间质细胞较多;与正常对照组相比，模型组大鼠胃粘膜不完整，粘膜层次结构不清楚，腺体排列紊乱，血管数量减少，间质细胞数量减少;中药各组大鼠胃粘膜尚完整，粘膜层次结构较清楚，腺体排列较整齐，血管数量较丰富，间质细胞数量较多。
　　 5各组大鼠胃组织Cx43的表达
　　 正常对照组大鼠胃组织中Cx43呈棕黄色的阳性表达，Cx43阳性表达密集分布在胃体和胃窦部环形肌层中，Cx43阳性表达水平用平均灰度值表示，灰度值越高其阳性表达水平越低，即细胞内相关蛋白含量越低;与正常对照组相比，模型组、中药各组Cx43的棕黄色阳性表达明显减少，Cx43平均灰度值明显增高(P＜0.05);与模型组相比，中药各组Cx43的棕黄色阳性表达增多，Cx43平均灰度值降低(P＜0.05）;中药组间相比，中药ZY(C)组较中药ZY(A)组、中药ZY(B)组Cx43的棕黄色阳性表达增多，Cx43灰度值降低。(P＜0.05)
　　 6各组大鼠胃组织SP的表达
　　 P物质主要分布在大鼠的胃窦环肌层与纵肌层的肌间神经丛周围，黏膜下丛也有少许分布。正常对照组大鼠肌间神经丛的SP免疫阳性物质丰富，多呈棕黄色成团分布在胞浆中，染色明显，着色较深;与正常对照组相比，模型组、中药各组大鼠肌间神经丛的SP免疫阳性物质减少，一些为细颗粒状，一些为棕黄色成团散在于胞质中，胃窦肌间神经丛内SP阳性单位明显低于正常对照组大鼠(P＜0.05）;与模型组相比，中药各组大鼠肌间神经丛SP免疫阳性物质增多，胃窦肌间神经丛内SP阳性单位高于模型组大鼠(P＜0.05）;中药组间相比，中药ZY(C)组较中药ZY(A)组、中药ZY(B)组大鼠肌间神经丛SP免疫阳性物质增多，胃窦肌间神经丛内SP阳性单位高于中药ZY(A)组、中药ZY(B)组大鼠。(P＜0.05)
　　 7各组大鼠胃组织nNOSmRNA表达的结果
　　 各组大鼠胃组织nNOSmRNA含量的表达结果显示:与正常对照组相比，模型组、中药各组nNOSmRNA含量均显著降低(P＜0.05);与模型组相比，中药各组nNOSmRNA含量均升高(P＜0.05);中药组间相比，中药ZY(C)组nNOSmRNA含量较中药ZY(A)组、中药ZY(B)组nNOSmRNA含量高。(P＜0.05)
　　 结论:
　　 1糖尿病胃轻瘫大鼠存在明显的胃排空障碍;活血化瘀通络中药可明显改善糖尿病胃轻瘫大鼠胃排空率及血糖情况，对糖尿病胃轻瘫有治疗作用。
　　 2活血化瘀通络中药可明显增加糖尿病胃轻瘫大鼠胃组织中Cx43的表达，进而修复细胞之间的间隙连接，维持ICC与平滑肌之间动作电位的传导，促进平滑肌收缩，此可能为其治疗糖尿病胃轻瘫胃排空障碍的机制之一。
　　 3活血化瘀通络中药可明显提高糖尿病胃轻瘫大鼠胃组织中SP的表达，提示其改善糖尿病胃轻瘫胃排空障碍作用可能是通过促进SP调节ICC的起搏电流，影响ICC的活动，进而增加平滑肌的收缩实现的。
　　 4活血化瘀通络中药可明显上调糖尿病胃轻瘫大鼠胃组织中nNOSmRNA的表达，其机制可能是通过促进nNOS释放神经递质，进而调控平滑肌收缩，达到改善糖尿病胃轻瘫胃排空障碍的作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 主要试剂的配制

3 方法

4 统计分析

结果

1 大鼠一般状况的比较

2 各组大鼠血糖及体重的比较

3 各组大鼠胃排空率的比较

4 HE染色结果

5 各组大鼠胃组织Cx43的表达

6 各组大鼠胃组织SP的表达

7 各组大鼠胃组织nNOS mRNA表达的结果

附图

附表

讨论

1 Cx43与DGP关系

2 SP与DGP关系

3 nNOS与DGP关系

4 活血化瘀通络中药对DGP的干预作用

5 活血化瘀通络中药对DGP大鼠血糖的影响

6 活血化瘀通络中药对DGP大鼠胃排空率的影响

7 活血化瘀通络中药对DGP大鼠胃组织病理学的影响

8 活血化瘀通络中药对DGP大鼠Cx43、SP及nNOS表达的影响

结论

参考文献

综述 胃肠神经-ICC-平滑肌网络与糖尿病胃轻瘫

致谢

个人简历