T细胞来源Exosomes调节妊娠丢失孕鼠外周T细胞功能诱导母胎免疫耐受的研究

摘要

目的:反复妊娠丢失指自然流产连续发生3次或3次以上者，其发生率约占自然流产病例的3％-5％，但仍有50％-60％原因不明，称为不明原因反复妊娠丢失(URSA)，严重影响着孕妇的身心健康。随着生殖免疫医学的发展，研究表明URSA主要与免疫因素有关，是母体对胎儿免疫排斥的结果。妊娠是一种同种异体移植，胚胎被母体的免疫机制识别并接纳后，妊娠才能得以正常维持。因此，诱导母体对同种异体胎儿抗原的免疫耐受是治疗的关键。
　　 国内外研究表明当前临床多采用免疫细胞过继疗法治疗URSA，诱导母体对同种异体胚儿抗原的免疫耐受，但是这种方法存在较多的局限性。本研究采用流产实验动物模型，分析T细胞来源的非细胞成分Exosomes调节妊娠丢失孕鼠外周T细胞功能以诱导母胎免疫耐受，确定分析T细胞来源Exosomes取代传统“免疫细胞过继疗法”治疗妊娠丢失的免疫学机制，为今后开展临床应用奠定实验基础并提供理论依据。
　　 方法:
　　 1、雄性无关个体脾细胞及其Exosomes的制备和初步鉴定:断颈处死BALB/c雄鼠，无菌条件下解剖取脾组织，获得单个细胞悬液，采用蔗糖密度梯度离心联合超滤技术获得Exosomes;通过扫描电镜、透射电镜观察Exosomes的形态、结构，紫外分光光度法测定其蛋白含量。
　　 2、妊娠丢失实验动物模型的建立:雌雄小鼠随机分为4组后按2∶1合笼交配;CBA/J(♀)×BALB/c（(♂)）为正常妊娠对照组(Contro组)，CBA/J(♀)×DBA/2((♂))为URSA组。再将URSA孕鼠分别于孕第4天无特殊处理，给予尾静脉注射无关个体BALB/c雄鼠脾单个核细胞及无关个体BALB/c雄鼠脾T细胞来源的Exosomes，随机分为妊娠丢失组(URSA组)、细胞治疗组(Cellular Therapy组)、非细胞治疗组(Non-cellular Therapy组)。
　　 3、胚胎发育情况的观察:于妊娠第14天分别将各组CBA/J孕鼠处死，测量计算胎盘体积，计数各组吸收胚胎个数及存活胚胎个数，根据公式计算出胚胎吸收率及妊娠丢失率。
　　 4、母胎免疫耐受状况的分析:于妊娠第14天分别处死各组CBA/J孕鼠，无菌解剖取脾组织，制备单个脾细胞悬液。MTT染色法检测单向混合淋巴反应、双向混合淋巴反应中T细胞转化的A492值。
　　 5、孕鼠外周T淋巴细胞免疫功能变化的检测:于妊娠第14天分别处死各组CBA/J孕鼠，无菌解剖取脾组织，制备单个脾细胞悬液。直接荧光标记流式细胞计数(FCM)分别检测T细胞表面CD3、CD4、CD8、CD247、CD25、IL-17、CD28、CTLA-4的表达，分别计算CD3+、CD4+CD8-、CD4-CD8+、CD3+CD247+、 CD4+CD25+、IL-17+、 CD4+CD28+、CD4+CTLA-4+细胞的百分率。
　　 6、统计学处理:各组数据均通过SPSS13.0版本软件进行正态性、方差齐性检验，采用卡方检验比较各组孕鼠胚胎发育情况;采用F检验对孕鼠T细胞免疫功能进行单因素方差分析(ANOVA)，S-N-K法进一步对多个样本均数间进行两两比较。
　　 结果:
　　 1、雄性无关个体脾脏T细胞来源Exosomes的初步鉴定
　　 形态及超微结构观察及蛋白定量。扫描及透射电镜下观察，T细胞分泌的Exosomes为脂质双分子层膜包围的球体，呈椭圆形或圆形杯口状，胞膜完整，直径约为30nm～100nm，内为低电子密度物质。紫外分光光度法蛋白定量显示Exosomes的A280值为0.343±0.029。
　　 2、不同过继转输对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响
　　 Control组孕鼠的胚胎吸收率为5.25％，URSA组为20.78％，细胞治疗组、非细胞治疗组分别为7.81％、3.18％。与URSA组相比，细胞治疗组及非细胞治疗组胚胎吸收率均显著下降(均P＜0.01)，并且均下降至Control组水平（均P＞0.05）;非细胞治疗组胚胎吸收率显著低于细胞治疗组(P＜0.05）。
　　 Control组孕鼠的妊娠丢失率为20％，URSA组为62％，细胞治疗组、非细胞治疗组分别为22％、22％。与URSA组相比，细胞治疗组及非细胞治疗组妊娠丢失率均显著下降(均P＜0.01)，且均下降至Control组水平（均P＞0.05）;两治疗组组间比较无明显差异(P＞0.05）。
　　 3、母胎免疫耐受状况的分析
　　 单向淋巴细胞混合反应，Control组、URSA组及细胞治疗组、非细胞治疗组孕鼠脾细胞的A492值(分别为0.584±0.060、0.697±0.035，0.411±0.024、0.313±0.191)。其中，Control组与URSA组之间明显差异(P＜0.05);细胞治疗组、非细胞治疗组较之显著下降(均P＜0.05)，细胞治疗组、非细胞治疗组无明显差异(P＞0.05）。
　　 双向淋巴细胞混合反应，Control组、URSA组及细胞治疗组、非细胞治疗组孕鼠脾细胞的A492值(分别为0.551±0.308、0.478±0.116，0.702±0.126、0.563±0.134)。其中，Control组与URSA组之间有明显差异（P＜0.05）;细胞治疗组较之显著上升（P＜0.05），非细胞治疗组较之无明显差异(P＞0.05)，细胞治疗组、非细胞治疗组有明显差异（P＜0.05）。
　　 4、外周T淋巴细胞功能的检测
　　 4.1、CD4、CD8的表达变化
　　 与Control组外周T细胞CD3表达百分率(33.47％±11.78％)相比，URSA组表达百分率显著升高(43.43％±5.41％，P＜0.01);经细胞治疗、非细胞治疗后无明显变化（分别为42.17％±7.43％，41.62％±7.21％，P＞0.05），两治疗组组间比较无明显统计学意义(P＞0.05）。
　　 与Control组外周T细胞CD4+CD8-表达百分率(23.09％±3.02％)相比，URSA组表达百分率显著升高(29.02％±5.74％，P＜0.01);经细胞治疗、非细胞治疗后显著降低(分别为20.25％±7.70％、22.86％±8.98％，均P＜0.01)至Control组水平(均P＞0.05);两治疗组组间比较无明显统计学意义(P＞0.05）。
　　 与Control组外周T细胞CD4-CD8+表达百分率（30.64％±1.55％）相比，URSA组表达百分率显著降低(27.24％±1.70％，P＜0.01);经细胞治疗、非细胞治疗后显著升高(分别为32.45％±2.12％、31.72％±0.98％，均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;两治疗组组间比较无明显统计学意义(P＞0.05）。
　　 与Control组外周T细胞CD4/CD8表达百分率（1.04％±0.21％）相比，URSA组表达百分率显著升高（1.50％±0.63％，P＜0.01）;经细胞治疗、非细胞治疗后显著降低(分别为1.06％±0.11％、1.06％±0.29％，均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;两治疗组组间比较无明显统计学意义(P＞0.05）。
　　 4.2、CD3+CD247+的表达变化
　　 与Control组外周T细胞CD3+CD247+表达百分率(3.77％±1.79％)相比，URSA组表达百分率显著降低（0.13％±0.06％，P＜0.01）;经细胞治疗、非细胞治疗后显著升高(分别为3.30％±0.99％、3.57％±0.78％，均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;两治疗组组间比较无明显统计学意义(P＞0.05)。
　　 4.3、调节性T细胞的表达变化
　　 与Control组外周T细胞CD4+CD25+表达百分率（1.68％±0.75％）相比，URSA组表达百分率显著升高(1.26％±0.85％，P＜0.01);经细胞治疗、非细胞治疗后显著降低(分别为2.00％±0.89％、2.10％±0.70％，均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;两治疗组组间比较无明显统计学意义（P＞0.05）。
　　 与Control组外周T细胞IL-17+表达百分率(2.49％±0.14％)相比，URSA组表达百分率显著升高(1.21％±0.11％，P＜0.01);经细胞治疗、非细胞治疗后显著降低(分别为2.24％±0.52％、2.38％±1.02％，均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;两治疗组组间比较无明显统计学意义（P＞0.05）。
　　 4.4、正负向协同刺激因子细胞表达的变化
　　 与Control组脾细胞CD4+CD28+表达百分率（4.91％±1.21％）相比，URSA组表达百分率显著下调（1.73％±0.84％，P＜0.01）;经细胞治疗、非细胞治疗后显著升高(分别为4.05％±1.23％、4.12％±1.28％，均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;两治疗组组间比较无明显统计学意义(P＞0.05）。
　　 与Control组脾细胞CD4+CTLA-4+表达百分率（0.82％±0.08％）相比，URSA组表达百分率显著升高（3.08％±0.37％，P＜0.01）;经细胞治疗、非细胞治疗后显著降低(分别为0.77％±0.11％、1.20％±0.30％，均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;两治疗组组间比较无明显统计学意义(P＞0.05)。
　　 结论:
　　 1、过继转输雄性个体外周T淋巴细胞或其分泌的非细胞成分Exosomes均可有效诱导母胎免疫耐受，过继转输Exosomes可发挥更强的母胎免疫耐受诱导效应。
　　 2、雄性个体外周T淋巴细胞及其分泌的非细胞成分Exosomes均可通过共同或相似的作用途径引发母体外周T淋巴细胞功能发生变化，有效诱导母胎免疫耐受。
　　 3、进一步明确了雄性个体外周T淋巴细胞及其分泌的非细胞成分Exoso-mes诱导母胎免疫耐受的免疫学机制，为今后开展临床应用奠定实验基础并提供理论依据。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学处理

结果

1 Exosomes的初步鉴定

2 不同过继转输对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响

3 母胎免疫耐受状况的分析

4 外周T淋巴细胞功能的检测

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历