肌萎缩侧索硬化转基因小鼠脑干及其运动核的自噬改变及二相酶表达变化研究

摘要

目的:肌萎缩侧索硬化(AmyotrophicLateralSclerosis，ALS)是运动神经元疾病的一种亚型，是一种常见的致命的慢性进行性中枢神经系统变性疾病，选择性侵犯上、下运动神经元，一般不侵犯感觉系统，以脊髓、脑干和大脑选择性的运动神经元变性为特征，累及部位为大脑皮层运动神经元、脊髓前角运动神经元和脑干运动神经核团。起病缓慢，进行性发展，表现为进行性加重的肌肉萎缩无力、肌束震颤、丧失运动功能而瘫痪，肌张力增高、腱反射亢进、病理征阳性，并出现构音障碍、吞咽困难。因缺乏有效的治疗，患者多在首发症状出现后的3-5年内死于延髓麻痹或呼吸肌逐渐萎缩无力而引起的呼吸衰竭。根据其起病方式可分为两类:5-10％的家族性ALS（fALS）和90-95％的散发性ALS(sALS)[1]。
　　 ALS症状的出现可发生在四肢的肌肉（脊髓发病），或者头部和颈部（延髓发病）。大约25％病人在发病初期脑干运动核团即受累，出现咽喉肌麻痹和舌肌萎缩，且病情严重、发展迅速，通常在诊断1-2年内因呼吸肌麻痹或继发肺部感染而死亡[2]，而且几乎所有病例在疾病进展过程中均表现出脑干受累症状[3]。临床表现为构音、吞咽、呼吸功能异常，严重影响生活质量和生存期。初步确定脑干中三叉神经核、面神经核、疑核、舌下神经核为受累核团，眼球运动核团为未受累核团。
　　 目前关于选择性运动神经元损害的假说主要有:氧化应激、线粒体功能障碍、蛋白质错折叠及异常聚积、谷氨酸盐兴奋性中毒、自身免疫反应等。但单一任何一种假说都无法完全解释ALS的选择性运动神经元的损害，因此ALS的发病机制不可能是单一因素引起，而应是多种因素共同作用的结果，但是这些因素之间的相互作用以及以哪些因素为主还不清楚。
　　 尽管在人类ALS病例中脑干受累较普遍且表现严重，但相较脊髓和运动皮层来说研究较少。所以，本实验用国际公认的ALS动物模型SOD1-G93A小鼠作为研究对象，研究不同时期小鼠脑干不同部位自噬和氧化应激相关指标的变化，探讨其在脑干运动神经元变性中的作用，为ALS治疗提供新的靶点。
　　 方法:
　　 1转基因小鼠的繁殖
　　 SOD1-G93A转基因小鼠在恒温(25-27℃)、恒湿和无特定病原菌（Specificpathogenfree，SPF）环境中饲养，给予灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料和无菌水。动物实验过程按照河北省实验动物管理办法规定实行。以B6SJLBTg(SOD1-G93A)1Gur/J半合子雄鼠与B6SJLF1/J雌鼠交配繁殖。两种小鼠均购自美国Jackson实验室(BarHarbor,ME，USA)，最初由Gurney等研制。子代鼠在出生后三周左右取尾尖部组织提取DNA并经PCR扩增，鉴定是否携带有人突变SOD1基因。
　　 2转基因小鼠运动功能评分及实验分组
　　 2.1运动功能评分
　　 从小鼠50天开始每天进行运动功能评分一次。分为五个阶段。
　　 (1)无运动障碍，无体重减轻为4分;
　　 (2)悬尾时后肢震颤为3分;
　　 (3)步态异常为2分;
　　 (4)至少一侧后肢拖拽1分;
　　 (5)将小鼠仰或侧卧，30秒内不能翻正0分。
　　 2.2实验分组
　　 依据SOD1-G93A小鼠的发病规律在3个时间点取材，分别为症状前期（60天）、症状早期（100-120天）和终末期（130-150天）。症状前期体重无减轻且无临床症状出现，评分为4分。症状早期指体重开始减轻并出现步态异常，评分为2分。终末期体重减轻达20％以上且仰卧30秒不能翻身，评分为0分。每个时期又设有模型组和同窝对照组。模型组为SOD1-G93A转基因小鼠，对照组为非转基因同窝对照小鼠，每组每个时期6只小鼠。
　　 3实验方法
　　 3.1取材
　　 各时期小鼠及同窝对照小鼠在相应时间点取材。用10％的水合氯醛(350mg/Kg)腹膜内注射麻醉后，分别于4％多聚甲醛灌流固定保存或新鲜取脑干组织迅速投入液氮速冻后于-80℃冰箱保存。
　　 3.2免疫印迹法(Westernblotting)
　　 对中脑、脑桥和延髓分别提取总蛋白，BCA法测取蛋白浓度。每个样品按60μg蛋白上样，10％SDS-PAGE电泳后转膜至PVDF膜，室温脱脂奶粉(PBS稀释)封闭1小时后，分别加兔抗P62抗体、羊抗SOD1抗体、兔抗LC3抗体、兔抗CD11b抗体、兔抗GFAP抗体、兔抗ACTIN抗体、鼠抗GAPDH抗体、兔抗HO-1抗体、羊抗NQO1抗体、兔抗GCLC抗体4℃置于摇床上过夜。次日，TPBS洗膜3次，PBS洗膜1次，每次洗5分钟。然后分别加相应荧光二抗室温孵育1小时，TPBS洗膜3次，PBS洗膜1次，每次洗5分钟，使用Odyssey红外扫描成像系统（美国LI-COR公司）扫膜后分析结果。计算目的条带与ACTIN或GAPDH灰度的比值，最后进行统计学分析。
　　 3.3免疫组织化学法
　　 脑干组织用4％多聚甲醛固定，使用LeicaVT1000S振动切片机切成25μm厚的切片，0.01MPBS溶液漂洗3次，每次5分钟;3％的H2O2浸泡15分钟，封闭内源性过氧化物酶;0.01MPBS漂洗3次，每次5分钟，0.3％的tritonX-100穿孔1次，15分钟。10％的马血清室温封闭1小时后，分别加入鼠抗SMI-32抗体、鼠抗NeuN抗体、兔抗P62抗体、兔抗LC3抗体、兔抗Iba1抗体、兔抗GFAP抗体4℃摇床过夜;0.01MPBS洗3次，每次5分钟后，分别加相应二抗，室温置于摇床上2小时;0.01MPBS洗3次，每次5分钟;加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温置于摇床上1小时;0.01MPBS洗3次，每次5分钟后，DAB显色10分钟，捞片，脱水，透明及封片。OlympusBX51显微镜观察及照相。
　　 3.4免疫荧光法
　　 与免疫组化方法相似，脑干组织经4％多聚甲醛固定后，经LeicaVT1000S振动切片机切成30μm厚的切片，经漂洗、穿孔、封闭、一抗、荧光二抗孵育，PBS漂洗后，抗荧光衰减封片剂封片，OlympusFV1000激光共聚焦显微镜观察及照相。
　　 3.5统计学分析
　　 采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计处理，采用多样本参数方差分析。测定结果以均数±标准差（(X)±s）表示，采用检验水准α=0.05，P＜0.05有统计学意义。
　　 结果:
　　 1转基因小鼠的鉴定
　　 子代鼠基因组DNA的PCR产物电泳显示:位于300-400bp之间有一条带(324bp)，为内参照IL-2的PCR产物;位于200-300bp之间的条带(236bp)，为突变SOD1基因的PCR产物。
　　 2运动功能变化
　　 在出生后60天以前SOD1-G93A小鼠无明显运动功能变化，与对照组小鼠一样，评分为4分。在80-90天左右，SOD1-G93A小鼠在悬尾实验时开始出现双后肢的震颤，评分为3分。在100-120天左右，一侧或双侧后肢逐渐出现明显的无力、肌肉萎缩以及步态异常，评分为2分。以后，随着病情的进展，双后肢出现进行性的肌肉萎缩，并不能支撑身体，至少一侧后肢出现完全性瘫痪，行走时出现拖拽现象，评分为1分。大约在130-150天左右，SOD1-G93A小鼠的四肢均受累，使其仰卧，30秒内不能自行翻转，体重降低超过20％，达到终末期，评分为0分。同窝对照组小鼠不出现上述情况，表现活跃，评分始终为4分。
　　 3SOD1-G93A转基因小鼠终末期脑干舌下神经核、面神经核、红核运动神经元明显减少，且存在显著的星形胶质细胞和小胶质细胞增生;GFAP和CD11b蛋白表达量随病程进展进行性增多，终末期达高峰(P＜0.05)。动眼神经核无明显神经元丢失及胶质增生。
　　 4肌萎缩侧索硬化转基因小鼠脑干及其运动核存在自噬通路异常
　　 4.1免疫印迹法研究发现，SOD1-G93A转基因小鼠脑干不同部位包括中脑、桥脑及延髓中P62、突变SOD1和LC3Ⅱ表达随病程进展进行性增多，终末期达高峰(P＜0.05)，各时期中脑、脑桥、延髓之间无明显差异。
　　 4.2免疫组化法研究发现SOD1-G93A转基因小鼠脑干中舌下神经核、面神经核和红核部位可见大量P62聚集体形成，残存神经元呈P62和LC3强阳性，动眼神经核P62和LC3表达与非转基因对照小鼠相比无明显差别。
　　 4.3免疫荧光法研究发现SOD1-G93A转基因小鼠脑干舌下神经核、面神经核和红核中残存神经元高表达突变SOD1蛋白，且突变SOD1与GFAP阳性星形胶质细胞间存在共定位;聚集的P62蛋白主要表达于残存神经元及其突起，而与GFAP阳性星形胶质细胞间不存在共定位;LC3表达呈弥漫性增强。动眼神经核P62和LC3表达与非转基因对照小鼠相比无明显差别。
　　 5肌萎缩侧索硬化转基因小鼠脑干及其运动核的二相酶表达上调
　　 免疫印迹法研究发现终末期SOD1-G93A转基因小鼠脑干不同部位HO-1、NQO1和GCLC表达明显增多(P＜0.05)，且中脑、脑桥、延髓之间无明显差异。HO-1表达在脑干各部位均随病程进展进行性增多。
　　 结论:SOD1-G93A小鼠是研究肌萎缩侧索硬化延髓麻痹的理想动物模型，脑干中舌下神经核、面神经核、红核为受累核团，动眼神经核为未受累核团。在SOD1-G93A转基因小鼠的中脑、脑桥和延髓，存在突变SOD1聚集，神经元变性减少，星形胶质细胞和小胶质细胞增生;自噬底物P62聚集和自噬体标记物LC3Ⅱ增多;氧化应激相关指标HO-1、NQO1和GCLC表达增多。与以往在腰髓的研究相一致，说明ALS的脑干受累与腰髓受累有相同的机制，均存在自噬通路异常和氧化应激。但具体到不同的脑干核团，受累情况不一，可能是由于不同核团神经元的易损性不同所致。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 转基因小鼠的鉴定

2 运动功能变化

3 肌萎缩侧索硬化转基因小鼠脑干及其运动核存在神经元变性及胶质增生

4 肌萎缩侧索硬化转基因小鼠脑干及其运动核存在自噬通路异常

5 肌萎缩侧索硬化转基因小鼠脑干及其运动核的二相酶表达上调

附图

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历