Capase-12在家族性肌萎缩侧索硬化模型hSOD1G93A转基因小鼠脊髓及运动皮层中的表达变化

摘要

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一种致命性的进展迅速的运动神经元变性疾病，主要累及脊髓、脑干以及皮层的运动神经元。这种疾病的特点是由于肌肉无力导致的肌萎缩，随着疾病进展通常几年之内死亡。大约有10%的ALS是家族遗传，这其中将近20%由于编码超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase1，SOD1)的基因突变所产生。G93A-SOD1转基因小鼠发病进展性、选择性运动神经元缺失以及表与人ALS相似的临床表现，因此被认为是最具有代表性的ALS动物模型。
　　1991年Siddique首次发现了ALS与第21号染色体有关，两年后Rosen等人发现了11种疾病与SOD1突变有关。目前已经发现SOD1中有100多个突变点引起常染色体显性遗传ALS疾病发生，这种突变可以导致氨基酸置换或者错误翻译中止。其中最主要的突变形式是错义置换，这种错义置换分布在基因五个外显子上。最常见的突变位点即外显子中密码子4位丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val)即A4V突变。最初的假定认为突变会损害蛋白酶活性，因此会增加细胞内活性氧化物质、氧化应激以及神经元死亡。然而随后的研究发现一些突变基因仍然具有完全的催化活性，并且发现剩余酶活性与ALS临床进展、疾病表型没有关系。之后有关于动物模型的研究结论提出了反对意见。一些研究证明突变的SOD1(mutantSOD1，mSOD1)倾向于错误折叠形成细胞内聚集物。接下来，这些聚集物可能通过隔离其他对神经元生存必须的细胞质蛋白导致细胞的死亡。目前，已经建立有多种表达人SOD1(hSOD1)突变转基因啮齿动物模型，其中hSOD1G93A转基因小鼠是目前世界上公认的ALS发病机制及临床前药物研究的动物模型，应用最为广泛。
　　最近有关与ALS病人以及mSOD1转基因小鼠的研究发现内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)相关毒性可能与ALS病理机制有关。内质网是重要的细胞器，参与到多种蛋白的折叠和翻译前的修饰，同时是重要的细胞内钙存储器。当内质网内错误折叠蛋白质过分聚集时会引起内质网应激，引发未折叠蛋白反应(unfold protein response，UPR)。UPR是一种稳态机制最初由上调的伴侣蛋白起到保护作用，由三种内质网上游感受器激活介导：PERK(PKR-like ER kinase)，IRE-1(inositol-requiringenzyme1)和ATF6(activating transcription factor6)。
　　ALS中内质网过度应激就会通过凋亡信号途径引发细胞的死亡。目前已知内质网应激由多种途径引起凋亡，分别为：内质网钙离子释放和凋亡前因子上调、JNK途径、CHOP途径以及内质网应激特有caspase途径激活。
　　Caspase-12拥有一个caspase相关聚集位点并且特定于内质网的细胞质侧，被认为在内质网应激诱导凋亡机制中起到重要作用。caspase-12一旦激活就会启动下游凋亡通路。
　　最近有研究表明在hSOD1G93A小鼠的脊髓中存在内质网应激以及由其激引发的细胞凋亡。本文初步研究hSOD1G93A小鼠的脊髓以及大脑运动皮层中是否也存在内质网应激引发凋亡途径中caspase-12信号通路的激活。
　　目的：观察hSOD1G93A转基因小鼠的脊髓以及大脑运动皮层中内质网凋亡因子caspase-12的变化，揭示内质网应激及其诱导凋亡在ALS病理机制中的作用。
　　方法：第一部分：hSOD1G93A转基因小鼠的繁殖及鉴定以B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J半合子雄鼠及B6SJLF1/J+/+雌鼠配种，提取尾尖的DNA，进行PCR分析鉴定。经鉴定后将含有hSOD1G93A基因的小鼠列为本实验的实验组，不含hSOD1G93A基因的小鼠(即wtSOD1基因小鼠)列为对照组。
　　第二部分：观察hSOD1G93A转基因小鼠的脊髓以及大脑运动皮层中内质网凋亡因子caspase-12的变化方法：1.实验分组分为四组：第一组，含wtSOD1基因小鼠的对照组3只(120天)；第二组，症状前期hSOD1G93A转基因小鼠3只(60天)；第三组，症状早期hSOD1G93A转基因小鼠3只(100-120天)；第四种，终末期hSOD1G93A转基因小鼠3只(120-130天)。
　　2.取材首先5%的水合氯醛麻醉小鼠，其次4%多聚甲醛经小鼠心脏内灌注固定，然后取出腰髓以及大脑运动皮层区域，浸泡在4%多聚甲醛中(至少24小时)，震荡切片机连续切片，片厚约25μm。
　　3.免疫组化震荡切片标本0.01MPBS洗三次，各5分钟，10% H2 O2室温中15分钟，0.01MTBS洗三次，各5分钟，10%马血清封闭1小时，加入1:100 caspase-12兔多克隆抗体，4℃孵育摇床过夜；加入1:200生物素化山羊抗兔IgG常温摇床2 h；加入1:200辣根酶标记链霉卵白素常温摇床1h；DAB显色，终止显色，铺片、常规脱水、封片。
　　4.统计分析实验结果以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS13.0软件进行统计分析，四组采用完全随机统计资料的方差分析和SNK多重比较，统计结果以P<0.05为有显著性差异。
　　结果：1.经PCR鉴定，将将实验动物分为hSOD1G93A转基因小鼠和阴性小鼠。2.在脊髓中，cleaved caspase-12阳性运动神经元(即caspase-12进入细胞核中的)数量在症状早期组和终末期组较对照组和症状前期组明显增多具有统计学意义，症状早期较终末期增多具有统计学意义，而症状前期与对照组相比无明显变化。症状早期和终末期的运动神经元形态发生变化，如神经元体积变小，核固缩，神经元数量明显减少现象。3.在运动皮层中，未发现cleaved caspase-12阳性细胞，尚未发现运动神经元皱缩改变仅看到有部分运动神经元体积轻微变小。
　　结论：脊髓中，在症状前期组(约60天)没有发现内质网应激诱导凋亡因子caspase-12的改变，在ALS疾病症状早期出现明显的caspase-12的改变，并随着疾病的进展而加重，终末期运动神经元数量大幅减少。说明内质网应激诱导的凋亡参与了ALS的发病，但ALS明确的病理机制尚需进一步的研究。在运动皮层中没有发现caspase-12明显改变，说明大脑运动皮层中未发生内质网应激导致的凋亡，确切机制尚需要进一步研究。